作者：刘建博，张玉芳，周宇，黄桂南，郭敏
【摘要】 【目的】观察射麻止喘汤对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞（asmc）增殖的影响。【方法】选用spf级sd大鼠分为哮喘组和正常对照组，哮喘组采用卵清蛋白（ova）致敏并激发方法复制哮喘模型，造模成功后分别取各组支气管平滑肌进行细胞培养，倒置显微镜观察形态并经免疫荧光染色鉴定；给予大鼠灌胃高、中、低剂量的射麻止喘汤（剂量分别为64、32、6.4g·kg-1·d-1）制备含药血清；取2~5代asmc分别给予射麻止喘汤高、中、低剂量含药血清，蛋白激酶c（pkc）激活剂佛波醇12肉豆蔻酰13乙酸佛波酯（pma，10nmol/l），pkc抑制剂马来酰亚胺甲磺酸盐（ro318220，5μmol/l）干预；另设空白组（不给予任何药物血清干预）。采用四甲基偶氮唑盐（mtt）法检测各组asmc增殖（d值）。【结果】免疫荧光染色鉴定结果显示所培养的细胞为平滑肌细胞。正常大鼠pma组asmc的d值较空白组显著增高（p＜0.05），ro318220组、射麻止喘汤各剂量组d值与空白组比较差异均无显著性意义（p＞0.05）。哮喘模型大鼠pma组asmc的d值较空白组显著增加（p＜0.05），ro318220组、射麻止喘汤各剂量组d值均较空白组显著降低（p＜0.05），但射麻止喘汤各剂量组与ro318220组比较差异无显著性意义（p＞0.05）。WWW.11665.cOM【结论】射麻止喘汤治疗支气管哮喘的作用可能与其能抑制asmc增殖，影响哮喘的气道重塑过程有关。
【关键词】 射麻止喘汤/药理学；支气管哮喘/中药疗法；平滑肌细胞/病理学；细胞增殖；细胞培养；疾病模型，动物；大鼠
abstract: objectiveto observe the effect of shema zhichuan decoction（szd） on the proliferation of the airway smooth muscle cells（asmc） in asthmatic rats. methodsspecificpathogen free sd rats were randomized into asthmatic group and normal control group. the asthmatic group were sensitized with intraperitoneal injection of ovalbumin（ova） and challenged with intranasal application of ova. after successful modeling，bronchial smooth muscle cells were sampled for culturing，and their histological features were observed under invert microscope. immunofluenscent assay was used for identification. serum containing szd was prepared after administration of szd in the dosages of 64，32 and 6.4 g·kg-1·d-1 to the rats by gastric gavage. the subculture asmc of the 2nd to 5th generation were treated high，moderate and lowdosage szdcontaining serum，protein kinase c（pkc） activator of phorbol myristate acetate（pma，10 nmol/l） and pkc inhibitor of maleimide methanesulfonate（ro318220，5 μmol/l ），respectively. a blank control group was also set up. the proliferation of asmc was detected by methyl thiazolyl tetrazolium（mtt） assay. resultsthe cultured cells were identified as bronchial smooth muscle cells by immunofluenscent assay. for the normal rats，the absorption value of asmc was higher in pma group than that in the blank control group（p<0.05），but absorption value in ro318220 group and szd groups did not differ from that in the blank control group（p>0.05）. as for the asthmatic rats，the absorption value of asmc was higher in pma group，but lower in ro318220 group and szd groups than that in the blank control group（p<0.05），and the difference between ro318220 group and szd groups was insignificant（p>0.05）. conclusionthe possible therapeutic mechanism of szd for bronchial asthma is probably related with airway remodeling through inhibiting asmc proliferation.
key words:shema zhichuan decoction/pharmacology；bronchial asthma /tcd therapy；smooth muscle cells/pathology；cell proliferation；cell culture；disease models，animal；rats
支气管哮喘（bronchial asthma，简称哮喘），是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性过敏反应性疾病［1］。这种气道慢性过敏反应导致气道反应性的增加，出现广泛多变的气流受限。哮喘长期反复发作可导致气道出现不可逆性狭窄，支气管平滑肌肥厚，气道结构重建，既是气道高反应性的重要原因，也是顽固性哮喘重要的病理基础［2］。本研究通过复制大鼠哮喘模型，培养哮喘大鼠的气道平滑肌细胞（asmc），观察射麻止喘液对asmc增殖过程的影响，现报道如下。
1材料与方法
1.1药物射麻止喘汤由麻黄、射干、地龙、椒目、北杏仁、法半夏、桔梗、细辛、甘草按质量比 1∶1.2∶1∶0.6∶1.2∶1.2∶1.2∶0.6∶0.6组成，按传统煎药法制成浓度为20g/ml的水剂，临用时用蒸馏水稀释成一定浓度的水溶液。
1.2主要试剂及仪器鸡卵清蛋白、氢氧化铝凝胶购于广州齐云生物技术有限公司，佛波醇12肉豆蔻酰13乙酸佛波酯（pma）、马来酰亚胺甲磺酸盐（商品名：ro318220）购于美国sigma公司，ⅰ型胶原酶、高糖dmem培养基购于美国gibco公司，胎牛血清（fbs）购于hyclone公司，牛血清白蛋白（bsa）购于mbchem公司，木瓜蛋白酶购于merck公司，胰蛋白酶—乙二胺四乙酸消化液购于凯基生物公司，dhanks液购于吉诺生物有限公司，四甲基偶氮唑盐（mtt）试剂盒、大鼠单克隆抗体α肌动蛋白（αactin）、链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶联结（sp）免疫组化试剂盒（二抗）均由广州杰特伟生物公司提供，pariboyn085超声雾化机由广州市晖昴医疗器械公司生产，ix70倒置显微镜由日本olympus公司生产，co2培养箱由美国nuair公司生产，离心机由上海天本公司生产，mk3酶标仪由thermo公司生产，细胞计数板由上海安倍生产。自制雾化箱（35 cm×23 cm×21 cm），塑料透明，箱壁上有一大小可放入雾化器的孔。
1.3动物spf级sd雄性大鼠14只，体质量220～250g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：syxk（粤） 20080092。
1.4大鼠哮喘模型的复制［3］及分组将5只大鼠随机分为哮喘组3只和正常对照组2只。哮喘组第1天每只大鼠腹腔注射含10mg卵清蛋白（ova）和200mg氢氧化铝的生理盐水1.5ml，第8天重复致敏1次，第15天开始激发，将大鼠置于自制雾化箱内，用超声雾化器喷入含10mg/mlova的生理盐水，共激发30min，隔天1次，激发后大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快及轻度紫绀等哮喘发作症状，共激发4周。正常对照组注射和雾化的方法同哮喘组，但使用的药物是9g/l生理盐水。
1.5气道平滑肌细胞的培养、鉴定哮喘组和正常对照组大鼠在造模成功后分别取支气管平滑肌进行细胞培养，参照改良的salmon［4］方法培养大鼠asmc。大鼠最后1次激发后24h内，用100mg/l水合氯醛溶液（40ml/kg）腹腔注射麻醉，无菌开胸后迅速取出气管及肺组织，置入dhanks液中，用眼科镊轻轻刮去肺组织，分离出完整的气管、支气管，再用系结镊小心剔除外膜及结缔组织，眼科剪剖开气管、支气管，刮去内外膜，直至气管完全透明。将获得的支气管平滑肌组织尽量剪碎，置于含1mg/ml ⅰ型胶原酶、1mg/ml 木瓜蛋白酶、10mg/ml bsa的dhanks液中，37℃消化约30min后，室温，800r/min离心5min，弃上清，组织、细胞沉淀用dmem洗涤2次，最后用含体积分数20%fbs、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的dmem悬浮所分离的细胞，种植于25ml培养瓶，置于37℃、体积分数5%co2培养箱中培养，每2～3d换液1次，14d左右90%细胞融合后传代培养，实验选用2～5代细胞。培养细胞通过形态学观察并经αactin免疫荧光染色鉴定。
1.6药物血清制备将9只大鼠随机分为3组，分别为射麻止喘汤高、中、低剂量组（中药组），每组各3只，给药剂量分别相当于成人（60kg）每天用量的10、5、1倍，即分别为64、32、6.4g· kg-1· d-1。大鼠预先禁食12h后，灌胃给予相应药物，2h后加强给药1次。第2次给药后1h，无菌条件下自心脏采血，离心血清（3000r/min， 37℃、20min），血清经56℃、30min灭活，于-20℃冷藏备用。
1.7气道平滑肌细胞分组及干预培养的asmc按1×104个/孔接种于96孔板，用高糖dmem液培养24h，使细胞同步于g0期，然后再分别给予射麻止喘汤高、中、低剂量含药血清、蛋白激酶c（pkc）激活剂pma（10nmol/l）、pkc抑制剂ro318220（5μmol/l）干预。另设空白组，不给予任何药物血清干预，各组设10个复孔。同时换用含体积分数10%fbs的dmem继续培养24h后，检测各组asmc的增殖。
1.8mtt比色法检测asmc增殖96孔板内的asmc培养结束时，每孔加5mg/ml mtt20μl，培养4h后去培养液，加二甲基亚砜150μl摇匀，约10min后用酶联免疫检测仪于450nm处测定各孔吸光度（d）值。
1.9统计学方法采用spss 11.5统计软件包进行统计分析，多组间比较采用f检验，两两比较采用q检验，检验水平α=0.05。
2结果
2.1各组asmc生长情况及鉴定倒置显微镜下观察单个平滑肌细胞呈梭形，有较长细胞突起，核圆形居中，有1～2个核仁，3d左右细胞贴壁生长，7d左右贴壁细胞完全伸展，细胞伸出较长的突起并相互接触（图1-a1、b1，见彩图页第667页），14d左右细胞铺满瓶底，细胞生长致密时平行排列成束，部分重叠，表现为典型的“峰和谷”生长状态（图1-a2、b2见彩图页第667页）。传代细胞一般12～24h贴壁，6d左右融合90%，可继续传代。αactin免疫荧光法鉴定培养的细胞为平滑肌细胞。
2.2各组asmc增殖比较表1结果显示：正常大鼠pma组asmc的d值较空白组显著增高（p＜0.05），ro318220组及射麻止喘汤低、中、高剂量组与空白组比较差异均无显著性意义（p＞0.05）。表1各组对正常及哮喘模型大鼠asmc增殖的影响（略）
哮喘模型大鼠pma组asmc的d值较空白组显著增加（p＜0.05），ro318220组及射麻止喘汤高、中、低剂量组均较空白组显著降低（p＜0.05），射麻止喘汤各剂量组与ro318220组比较差异无显著性意义（p＞0.05）。
3讨论
在哮喘发病中的许多环节上，pkc信号转导通路起着重要作用。pkc是pkc信号转导途径的主要限速酶，广泛存在各种细胞中。pkc影响asmc表面β2受体功能及表达，影响ca2+交换和调控asmc增殖的速率，从而调控气道平滑肌（asm）功能及结构［5］。许淑云等［6-7］在研究中发现：哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖活性增加，哮喘组气道平滑肌细胞pkcα的mrna和蛋白表达均较正常对照组显著增高，提示pkc及其亚型pkcα可能参与哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖，在哮喘气道平滑肌增殖的信号转导中具有重要作用。本研究参考许淑云等［7］的方法，选用不同药物血清对2～5代细胞进行干预，以观察不同药物血清影响下asmc的增殖情况。实验结果显示：正常大鼠pma组及哮喘模型大鼠pma组asmc的d值均较空白组显著增加（p＜0.05），但哮喘模型大鼠ro318220组d值较空白组显著降低（p＜0.05）。这些结果与既往研究［8］结果相同，都说明了pkc在细胞增殖，尤其在哮喘大鼠支气管平滑肌细胞增殖中起重要的调控作用。
支气管哮喘属于中医学“哮病”范畴。《症因脉治》曰：“哮病之因， 痰饮留伏， 结成窠臼，潜伏于内，偶有七情之犯，饮食之伤，或有时令之风寒束其肌表，则哮喘之症作矣。”哮喘的发作多是伏痰遇感引触，痰随气升，气因痰阻，相互搏结，壅塞气道，肺管狭窄，通畅不利，肺气宣降失常，引动停积之痰，而致痰鸣如孔，气息喘促。哮喘急性发作的病理环节为痰阻气闭，因此治疗上主要是以宣肺祛痰、下气降逆为法。而射麻止喘汤是根据张仲景的《金匮要略》中射干麻黄汤的加减方，具有宣肺平喘、祛风解痉、祛痰止咳的功效。既往实验研究［9-13］表明射麻止喘液对哮喘发病过程中的多种炎症细胞和炎症因子网络有干预作用，例如对哮喘模型大鼠有调节camp/cgmp失衡，抑制炎症细胞浸润；拮抗血栓素b2、促进前列环素生成，解痉、平喘；抑制炎症介质释放，降低气道高反应性；抑制肺毛细血管胶原纤维合成，保护支气管、肺组织等作用。
本实验结果表明，哮喘模型大鼠的射麻止喘汤各剂量组asmc的d值均较空白组显著降低（p＜0.05），说明射麻止喘汤各剂量组均能抑制哮喘大鼠支气管平滑肌细胞的增殖，影响哮喘的气道重塑过程。而射麻止喘汤各剂量组asmc的d值和ro318220组比较差异无显著性意义（p＞0.05），说明射麻止喘汤具有类似pkc抑制剂的作用，由此推测射麻止喘汤可能通过调控pkc信号转导机制，影响哮喘大鼠支气管细胞的增殖，进而影响气道重塑，降低气道高反应性，改善哮喘的预后，确切机制有待进一步检测pkc活性的变化情况来证实。
【参考文献】
［1］王吉耀．内科学［m］．北京：人民卫生出版社，2005.
［2］homer r j，elias j a．consequences of longterm inflammation：airway remodeling ［j］．clin chestmed，2000，21（2）：331.
［3］李昌崇，胡晓光，陈小芳，等．牛膝多糖对幼年哮喘大鼠模型气道炎症的影响［j］．中华结核和呼吸杂志，2003，26：644.
［4］salmon m，walsh d a，koto h，et a1．repeated allergen exposure of sensitized brownnorway rats induces airway cell dna synthesis and remodeling［j］．eur respir j，1999，14（3）：633.
［5］刘先胜，徐永健，张珍祥．蛋白激酶c与气道平滑肌的功能调节［j］.国外医学： 生理、病理科学与临床分册，1998，18（2）：151.
［6］xu s y，xu y j，zhang z x，et a1．contribution of protein kinase c to passively sensitized human airway smooth muscle cells proliferation［j］．chin med j（eng1），2004，117（1）：30.
［7］许淑云，徐永健，张珍祥，等．蛋白激酶c在支气管哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖中的信号转导机制研究［j］．中华结核和呼吸杂志，2003，26（12）：756.
［8］钟南山．支气管哮喘——基础与临床［m］．北京：人民卫生出版社，2006.
［9］黄真炎，杨冬娣，吴玲霓，等．加味射干麻黄液对过敏性哮喘豚鼠肺超微结构变化的电镜观察［j］．中医药研究，1998，14（2）：27.
［10］周名璐，陈芝喜，梁直英，等．加味射麻液对哮喘豚鼠gmcsf和et水平的影响［j］．标记免疫分析与临床，2000，7（4）：203.
［11］陈芝喜，梁直英，周名璐，等． 射麻止喘液对哮喘豚鼠血浆环核苷酸和txb2，6kpgf1α水平的影响［j］．放射免疫学杂志，2000，13（2）：77.
［12］刘小虹，廖慧丽，梁直英，等．射麻止喘液对哮喘模型大鼠环核苷酸变化的影响［j］．广州中医药大学学报，2001，18 （4）：339.
［13］周名璐，梁直英，陈芝喜，等． 加味射麻液对哮喘豚鼠血清il4，tnf水平的影响［j］． 放射免疫学杂志，2001，14（2）：75.
