作者：安冉,杨锦芬,刘军民,翟明,徐鸿华
【摘要】 【目的】利用26s rdna d1d3区序列差异鉴别鸡血藤及其混淆品。【方法】使用改良十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取鸡血藤及其混淆品的总dna,选择浓度较高的样品作为模板dna,对26s rdna d1d3区进行pcr扩增、测序和序列比对分析。【结果】获得26s rdna d1d3区长约700 bp的序列。比对结果显示,不同产地之间鸡血藤的序列一致率为96%和100%,混淆品与正品比较的序列一致率为80%～96%。在26s rdna d1d3区384～472 bp的位置有足够的碱基差异位点用以区分鸡血藤及其混淆品。【结论】26s rdna d1d3区序列可以应用于鉴别鸡血藤及其混淆品。
【关键词】 鸡血藤;序列分析，dna
鸡血藤为豆科植物密花豆spatholobus suberectus dunn的干燥藤茎,其性温,味苦、甘, 归肝、肾经, 有补血、活血、通络的功效, 用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症[1]。商品鸡血藤药材基源植物除《中国药典》收载的密花豆外,还有豆科、五味子科、木通科等共6个属15种和变种的植物,如常春油麻藤、香花崖豆藤等[2]。wwW.11665.COM由于商品鸡血藤的来源复杂,临床中常出现混用现象。目前,对鸡血藤类药材的鉴别,多以传统鉴别方法为主,但这不足以简便、准确地鉴别其真伪。植物基因的26s rdna d1d3区中包含一个序列变异快的d2区可用于鉴别不同的植物,两端又有保守区域可供设计通用pcr引物,且该区域具有长短适宜,便于扩增、测序和比对的特点[3],因此,本研究选用26s rdna d1d3区对鸡血藤及其混淆品进行dna序列分析,旨在为鸡血藤种质评价与鉴定提供分子鉴别的依据,现报道如下。
1材料与方法
11药材实验所用的鸡血藤及其混淆品(见表1)采自我国鸡血藤主产区：广东、广西省区的野外及广州中医药大学三元里药圃,经广州中医药大学徐鸿华教授鉴定并确定其拉丁学名。分别采集幼嫩叶片,装于密封塑料袋内,用变色硅胶干燥,置于-20℃冰箱保存,备用。表1鸡血藤及其混淆品的产地来源
12试剂及仪器tris购自salandchem international inc,十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)均购自上海伯奥生物技术公司,乙二胺四乙酸(edta)购自天津福晨化学试剂厂,pcr试剂、dna marker购自大连宝生物技术公司,pcr产物纯化试剂盒购自北京赛百盛基因技术公司,引物由上海生工生物工程技术公司合成,ptc200型 pcr仪(美国biorad公司),dycp31水平电泳仪(北京六一仪器厂),infinity 1000/26m凝胶成像及分析系统(法国vilber lourmat公司)。
13总dna的提取采用ctab法[4]并加以改良。取01 g样品,用灭菌纯水把叶片冲洗干净,吸水纸吸去表面水分。加800 μl ctab提取液,石英砂适量。冰浴快速研磨1 min,转入2 ml离心管。65℃温浴20～40 min,间或轻摇离心管。将离心管取出,冷却至室温,加入等体积的氯仿—异戊醇(体积比24∶1)。将离心管上下颠倒几次,充分混匀,10 000 r/min离心15 min。吸取上清液400 μl,加入等体积的氯仿—异戊醇重复抽提1次,离心。取上清液300 μl,加07倍体积的冰冻异丙醇,缓缓平转离心管,可见白色的dna絮状物,4℃冰箱放置20 min～2 h。10 000 r/min离心15 min,弃上清液。用体积分数70%乙醇1 000 μl清洗沉淀2次,10 000 r/min离心5 min,倒出乙醇。沉淀室温风干后,加150 μl灭菌纯水溶解,-20 ℃保存，用10 g/l的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。
14pcr扩增及产物测序引物选用duan5(5’tagtaacggcgagcgaac3’)、duan6(5’ggcatagttcaccatctttc3’)[3] 分别做为上下游引物扩增26s rdna d1d3区。pcr反应总体积50 μl,含expcr buffer 5 μl,三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)375 μl,duan5、duan6各125 μl,ex taq 酶05μ l,模板dna 15 μl(约50 ng),灭菌水补足50 μl。扩增程序为：94 ℃预变性2 min后进入循环,94 ℃变性30 s,60 ℃复性30 s,72 ℃ 延伸1 min,循环29次;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的片段,送广州英骏生物技术公司用上下游引物进行双向测序。
15序列的同源性比对及提交ncbinlmnihgov/blastcgi,对测序所得序列进行blastn(nucleotide blast)同源搜索,确定所获序列是否为26s rdna基因序列。使用sequin软件向genbank提交所测得的7个样品序列,获得序列登记号。
16序列分析采用blastn的两序列比对功能(align two sequences using blast),以鸡血藤样品1的26s rdna d1d3序列为标准序列,分别与之比对获得序列之间的一致率。用dnaman软件对7个样品的序列进行多重比对,寻找差异位点,并构建系统发生树。
2结果与分析
21总dna的提取如图1所示,从叶片中提取到的7个样品的总dna浓度约为30～50 ng /μl 。
1鸡血藤1;2鸡血藤2;3鸡血藤3;4香花崖豆藤;
5常春油麻藤;6厚果鸡血藤;7鱼藤;
8dna marker(250 bp dna ladder)
图1总dna电泳图
figure 1electrophoregram of total dna of caulis
spatholobi and its adulterants
2226s rdna d1d3区扩增结果如图2所示,7个样品pcr扩增后均得到长度约为750 bp的清晰片段,与预期的26s rdna d1d3区700～800 bp的片段大小基本相符。
1鸡血藤1;2鸡血藤2;3鸡血藤3;4香花崖豆藤;
5常春油麻藤;6厚果鸡血藤;7鱼藤;
8dna marker(250 bp dna ladder)
图2pcr产物
figure 2pcr products of caulis spatholobi and its adulterants
23序列分析对各样品的pcr产物测序结果进行处理,得到鸡血藤及其混淆品的以“ttagtta”为始端和以“tgtg(a)aagg”为末端的698～707 bp序列。对所得的7个样品序列进行blastn同源性搜索,结果显示,与已知的大豆glycine max merrill的26s rdna部分序列(genbank登记号：ay935814)均有较高的序列一致性(见表2),其中最高达97%,证明本实验扩增获得的序列为26s rdna的部分序列。向genbank提交鸡血藤及其混淆品的7个26s rdna部分序列,获得相应的序列登记号(见表3)。
以鸡血藤样品1的26s rdna d1d3区序列作为标准序列,其他序列与之比对的结果显示,不同产地鸡血藤之间的序列一致率为96%或100%,4种混淆品与正品鸡血藤的序列一致率为80%～96%(见表2)。7个样品序列多重比对的结果检测到较多的碱基差异位点,其中差异位点较集中的区域位于384～472 bp(见表3),这些差异位点足以区分鸡血藤正品及其混淆品。表2序列比对表3基因差异位点
24亲缘关系分析以7个样品的26s rdna d1d3区序列构建系统发育树,结果如图3所示。厚果鸡血藤与不同属的常春油麻藤的亲缘关系较近,而与同属植物香花崖豆藤的亲缘关系反而较远。不同产地鸡血藤之间的遗传距离明显小于鸡血藤与混淆品之间的遗传距离,即属内(密花豆属)遗传距离明显小于属间(密花豆属与崖豆藤属、黧豆属、鱼藤属)遗传距离。图3基于26s rdna d1d3区构建的系统发育树
3讨论
kuzoff等[5]的研究表明,26s rdna序列存在d1d12共12个高变异的扩展区可用于鉴别不同的植物,扩展区的两端又存在变异较慢的保守区域可供设计通用pcr引物。本研究选用26s rdna序列中最具有代表性的26s rdna d1d3区域,尝试运用26s rdna d1d3区的序列分析从分子角度建立一种可以准确、快速地鉴别鸡血藤及其混淆品的方法。
本研究结果显示鸡血藤及其混淆品在26s rdna d1d3区域的碱基序列具有较高的保守性(正品鸡血藤与混淆品的序列一致率高达80%～96%)的同时,又存在较多的碱基差异位点,特别是在384～472 bp的区域(d2区)内存在足够的差异位点可区分不同种属的样品。表明不同产地鸡血藤之间的变异性小于鸡血藤与其混淆品之间的变异性,即种内变异性小于种间变异性,借此可以区分鸡血藤与其混淆品。
由于本研究材料的采集还不够广泛,加上物种本身的遗传多样性,这可能是造成系统发育树中表现的亲缘关系与传统分类法不完全一致(本文系统发育树显示,厚果鸡血藤与不同属的常春油麻藤的亲缘关系较近,而与同属植物香花崖豆藤的亲缘关系反而较远)的原因。
(致谢：本研究获得广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺教授和黄琼林研究生的大力支持和帮助,特此致谢!)
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[m].北京:人民卫生出版社,2005：134.
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[3]段中岗,陈蔚文.中药材dna条形码研究[r].广州中医药大学博士后出站研究工作报告,2008: 65-66,77.
[4]段中岗,黄琼林,杨锦芬,等.适合中药材dna条形码分析的dna提取方法的研究[j].中药新药与临床药理, 2009, 20(5):480.
[5]kuzoff p k, sweere j a, soltis d e, et al. the phylogenetic potential of entire 26s rdna sequences in plants[j]. molecular biology and evolution,1998, 15：251.
