作者：周瑶，杜标炎，谭宇蕙，吴映雅，刘喜娟，刘晶晶，易华，李药菊
【摘要】 【目的】观察山奈酚对大鼠肝癌细胞cbrh7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响。【方法】选用cbrh7919肝癌细胞株，传代培养24 h后，加入不同浓度山奈酚处理，采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测细胞存活率，4′6二脒基2苯基吲哚(dapi)染色观察细胞凋亡形态，彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞dna的作用。【结果】山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞cbrh7919的增殖，以625、125、25、50、100 μmol/l浓度的山奈酚处理细胞72 h，对cbrh7919细胞的增殖抑制率显著升高，呈明显的剂量效应关系。用50、100 μmol/l浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h，对细胞的增殖抑制作用显著增强，呈明显的时间效应关系，即药物作用时间越长，抑制作用越强。dapi染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征。彗星电泳显示30、60、120 μmol/l浓度的山奈酚作用于细胞72 h后，细胞后面均呈现长度不等的拖尾，平均光密度值较空白对照组显著降低(p<001)，彗星尾距较空白对照组显著增加(p<001)，且两者改变与药物浓度相关。流式细胞仪检测结果显示30、60、120 μmol/l浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰，细胞周期被阻滞于s期，不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高。WwW.11665.CoM【结论】山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞cbrh7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用。
【关键词】 山奈酚/药理学;肝肿瘤/中药疗法;肿瘤细胞/病理学;细胞凋亡;细胞培养
山奈酚主要来源于姜科植物山奈的根茎，属于黄酮醇类，黄酮类化合物是一类存在于多种植物中的多酚化合物，具有多种潜在的药用价值，其中抗肿瘤作用是一个研究热点[1-2]。有研究报道山奈酚通过不同作用机制能抑制大肠癌细胞[3]、大鼠前列腺癌细胞[4]、人乳腺癌细胞[5]、髓母细胞瘤细胞[6]、大鼠嗜碱性白血病细胞[7]、人宫颈癌hela细胞[8]等的生长或诱导其凋亡，并在人肝肿瘤细胞株hepg2细胞中能调节孕烷x受体(pxr)介导的细胞色素p450 3a4的转录表达，从而影响某些与其同时使用的临床药物的代谢[9]。本研究观察了山奈酚在体外对大鼠肝癌细胞cbrh7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验药物山奈酚购自sigma公司(批号：54608195，纯度>96%)。
12试剂与仪器大鼠肝癌细胞株(cbrh7919)购于中山大学细胞库。细胞培养用rpmi1640粉和胰蛋白酶均为gibco公司产品，青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司出品，新生牛血清为奥地利paa公司产品，四甲基偶氮唑盐(mtt)、二甲基亚砜(dmso)为美国sigma公司产品，琼脂糖为biowest公司产品。仪器有ix71f22fl/ph型荧光倒置显微镜及图像采集系统(日本olympus公司)和biorad680型全自动酶标仪(日本biorad公司)。
13细胞培养用完全培养基(含rpmi1640培养基、体积分数10%新生牛血清、100 u/ml青霉素、01 mg/ml链霉素)接种在培养瓶中，置体积分数5%co2、37℃培养至融合率80%～90%时传代进行实验，接种细胞浓度为1×105/ml。
144′6二脒基2苯基吲哚(dapi)染色观察细胞凋亡形态细胞培养24 h后，加不同浓度山奈酚处理，设0、25、50、100 μmol/l共4个浓度组，作用72 h后，dapi染色，倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。
15mtt法检测细胞存活率以2×104个/ml的密度将细胞接种于96孔板，每孔内有100 μl细胞悬液，后将山奈酚用乙醇溶解、培养基稀释为625、125、25、50、100 μmol/l共5个浓度组，加药至每孔培养液总体积200 μl。每组设6个复孔，培养箱中培养72 h，mtt法检测药物作用的量效关系。设50、100 μmol/l 2个浓度组，培养24、48、72、96 h，mtt法检测药物作用的时效关系。
16彗星电泳检测细胞dna损伤情况细胞培养24 h后，加不同浓度山奈酚处理，设0、30、60、120 μmol/l共4个浓度组，作用72 h后，分别收集各组的细胞，按文献[10-11]方法采用彗星电泳分析dna损伤的情况。dapi染色，荧光倒置显微镜40倍物镜下观察照相，每组随机选取20个细胞测量平均光密度(d)值和彗星尾距(l)相对值。
17流式细胞仪分析凋亡和细胞周期细胞培养24 h后，加不同浓度山奈酚处理，设0、30、60、120 μmol/l共4个浓度组，作用72 h后，分别收集各组的细胞，每组3孔，碘化丙啶(pi)单染上机检测分析。
18统计学方法采用imageproplus 51分析软件测量平均光密度值和彗星尾距。数据统计采用spss 130 for windows 软件处理。
2结果
21山奈酚对细胞生长形态和凋亡形态的影响光镜下观察空白对照组细胞多为多角形、长菱形，
表面光滑。经山奈酚处理的细胞整个胞体呈浓缩状，细胞表面有明显的迂曲，胞核内颗粒状物质增多，且药物作用浓度越高，细胞数目越稀疏。dapi染色后可见给药组细胞核溶解、碎裂，形状极不规则，染色质浓缩。结果见图1(彩图见第317页)。
22山奈酚对肿瘤细胞增殖抑制作用的量效、时效关系mtt法检测结果发现不同浓度山奈酚组均能抑制肿瘤细胞的生长，其作用呈明显的剂量效应和时间效应关系，药物作用时间越长，抑制作用越强。结果见表1、表2。表1不同浓度山奈酚对cbrh7919(72 h)的增殖抑制效应表2不同浓度山奈酚对cbrh7919不同时间点的增殖抑制效应
23不同浓度山奈酚组的细胞dna损伤情况图2(彩图见第317页)结果显示：彗星电泳后，凋亡细胞中形成的dna降解片段，在电场中泳动速度较快，在细胞后形成长的拖尾，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无dna断裂的核在泳动时保持圆球形。表3结果显示：经不同浓度山奈酚处理后的细胞核平均光密度值显著降低，彗星尾距显著增加，与空白对照组比较差异有显著性意义(p<001)，且两者改变与药物浓度相关。表3不同浓度山奈酚作用cbrh7919(72 h)的彗星电泳分析结果(x±s)
24各组流式细胞仪检测结果 dna直方图显示：不同浓度的山奈酚作用于肿瘤细胞株cbrh7919 72 h后，细胞周期被阻滞于s期，且均出现典型的亚二倍体凋亡峰。不同浓度山奈酚组的细胞凋亡率较空白对照组均有明显的增高。结果见表4、图3(彩图见第317页)。表4不同浓度山奈酚组对cbrh7919(72 h)
3讨论
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高居第3位。目前，肝癌的治疗仍以手术治疗为首选，但需要有明显的手术适应症，且复发率较高，临床常用化疗药物具有较大的毒副作用，故抗癌药物的研发特别是从天然植物中筛选抗癌新药，已成为抗癌药物研发的热点。
药物对肿瘤的抑制有很多方面，包括作用于细胞周期、代谢，诱导肿瘤细胞凋亡等 ，而目前治疗肿瘤广泛采用的策略就是诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。研究表明，肿瘤的发生、发展与细胞增殖分化以及异常凋亡有关，细胞凋亡的失控是肿瘤演变的重要因素之一，诱导肿瘤细胞的凋亡是化疗药物的重要作用机制之一[12-13]。近年来研究报道有多种中药及其提取物和中药复方在体内、外实验中通过多种途径诱导肝癌细胞凋亡[14-17]。
本研究采用山奈酚体外作用于大鼠肝癌细胞cbrh7919，实验结果表明：山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞cbrh7919的增殖，且与药物作用有明显的剂量效应和时间效应关系。dapi染色发现，给药组肿瘤细胞核染色质浓缩边聚、胞质浓缩、核碎裂以及凋亡小体形成，是典型的中、晚期细胞凋亡的特征。彗星电泳是近年发展起来的一种测定单个细胞dna损伤的方法，是一种快速简便的凋亡检测法[10-11]，具备许多其他实验无法比拟的优越性。本研究彗星电泳实验结果表明，经不同浓度山奈酚作用后，dna发生损伤，在细胞中均形成典型凋亡的彗星尾形态，平均光密度值和尾距较空白对照均有明显改变，且与药物浓度相关。流式细胞术检测表明，细胞经不同浓度山奈酚作用后，细胞被阻滞于s期，抑制了细胞分裂增殖，且阻滞比例与药物作用浓度呈正相关，细胞凋亡率也随着药物作用浓度的增加而升高。综上所述，山奈酚能通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤的作用，但其对肿瘤细胞作用的具体机制仍有待进一步研究。
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