摘要：从黄芪（radix astragalus）中提取黄芪甲苷，将其作用于thp-1细胞和thp-1吞噬结核杆菌菌株h37rv模型，考察黄芪甲苷促进thp-1吞噬结核杆菌的效果。结果表明，黄芪甲苷能强化thp-1细胞活力和其吞噬h37rv的能力，且试验范围内黄芪甲苷浓度越高作用效果越强。
　　关键词：黄芪（radix astragalus）甲苷；提取；thp-1；结核杆菌（mycobacterium tuberculosis）
　　中图分类号：r284.2；r285.5；r378.91+1 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）11-2632-02
　　结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见[1]。目前，结核病治疗主要采用异烟肼等药物，但存在耐药性等问题。黄芪（radix astragalus）又名黄耆，为豆科植物膜荚黄芪（astragalus membranaceus）的根，是一种常用中药，分布于我国内蒙古、山西等地区，具有补气固表、利水退肿等功效。现代研究表明，黄芪中所含的甲苷、黄酮等成分能够有效增强机体的免疫功能[2，3]。有报道显示黄芪能够强化巨噬细胞活力，帮助人体抵御并杀灭结核杆菌[4，5]。本研究从黄芪中提取黄芪甲苷，将其作用于thp-1细胞和thp-1吞噬结核杆菌h37rv菌株模型，检验黄芪甲苷促进巨噬细胞吞噬结核杆菌的功效，为黄芪活性成分的开发利用及抗结核病新药的研发奠定基础。WwW.11665.coM
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器
　　1.1.1 材料与试剂 黄芪购自安国市宝盛中药材有限公司，保存于河北经贸大学生物科学与工程学院材料库；结核杆菌h37rv菌株和thp-1白血病细胞株来自河北医科大学生化研究所。rpmi-1640培养基，青岛日水生物技术有限公司；胎牛血清，上海基峰生物有限责任公司；二甲基亚砜，姜堰市奥伦合成树脂有限公司；聚赖氨酸，兰州伟日生物工程有限公司。
　　1.1.2 主要仪器 mz型高速粉碎机，青岛迈科隆粉体技术设备有限公司；360ep电子天平，上海精科天美贸易有限公司；re-2000a旋转蒸发器，上海一凯仪器设备有限公司；knf循环水真空泵，上海诚铭科技有限公司；紫外可见分光光度计，上海天普分析仪器有限公司；bds200-ph倒置相差显微镜，天津西格光电科技有限公司；co2培养箱，上海三腾仪器有限公司；lp-160b数字酸度计，上海厚望科学仪器有限公司；bzy-1恒温槽，上海衡平仪器仪表厂；fzg真空干燥箱，南京康方机械科技有限公司；dg5033a酶联免疫检测仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 黄芪甲苷的提取 将黄芪干燥并粉碎，取150 g黄芪粉末，用1 500 ml体积分数75%的乙醇在80 ℃加热回流提取3次，每次加热回流提取时间分别为48、24、24 h。减压浓缩得乙醇浓缩液，再经85 ℃水浴处理60 min后用石油醚萃取。萃取后得到的溶液加入正丁醇，充分振摇，重复提取5次，合并提取液。加入氨试液25 ml，充分振摇，重复提取3次，获得黄芪甲苷提取液。
　　1.2.2 黄芪甲苷含量测定 取黄芪甲苷标准品5.0 mg，加无水乙醇溶解，混匀并定容至10 ml得到黄芪甲苷标准液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml黄芪甲苷标准液，用无水乙醇稀释至0.5 ml，再加入10%的香兰素乙醇溶液0.5 ml，经冰水浴处理后，加入70%的硫酸定容至10 ml，摇匀。以未添加黄芪甲苷标准液的处理为空白对照，测定其在544 nm波长处的吸光度，得到黄芪甲苷浓度（c//mg/ml）对吸光度（a544 nm）的线性回归方程为a=0.932c+0.047，相关系数r=0.988 7。
　　1.2.3 thp-1细胞的培养 thp-1细胞复苏解冻后，置于含15%小牛血清的rpmi 1640细胞培养基内，培养条件为co2浓度8%、温度36 ℃。thp-1细胞生长到指数生长期时调整细胞浓度为1.5×105 cell/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加培养基至体积为2 ml，在co2浓度8%、温度36 ℃的环境下继续培养72 h。
　　1.2.4 黄芪甲苷对thp-1细胞活力影响 将thp-1细胞培养至分化阶段，在2 ml培养基中加入25 μl含不同浓度黄芪甲苷（0、0.10、0.25、0.40 mg/ml）的rpmi 1640培养液，培养箱内再培养36 h，加入25 μl 5 mg/ml的噻唑蓝，继续培养6 h，经离心处理后，吸去培养板孔内的培养基，各孔中加入160 μl二甲基亚砜，充分振荡之后测定各孔光密度值（od），取平均值。
　　1.2.5 结核杆菌预处理 取2 ml经过灭活处理的h37rv加入15 ml培养基混匀，控制菌浓度为5×106 cfu/ml。
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.2.6 thp-1细胞吞噬h37rv模型 取分化到指数生长期的thp-1细胞，调整浓度为5×104 cell/ml，接种于24孔细胞培养板，每孔接种1 ml，加入丙二醇甲醚醋酸酯（pma）10 ml，静置48 h诱导分化，之后加入1 ml 5×105 cfu/ml的h37rv，再加入含不同浓度黄芪甲苷（0、0.10、0.2
　　2.3 黄芪甲苷对thp-1吞噬h37rv的影响
　　不同浓度黄芪甲苷对thp-1吞噬h37rv的影响结果见图2。由图2可知，培养基中添加黄芪甲苷能促进thp-1细胞对结核杆菌h37rv的吞噬作用，不同浓度的黄芪甲苷处理后thp-1细胞对h37rv的吞噬率和吞噬指数都显著高于对照（p<0.05），且在试验范围内黄芪甲苷浓度越高吞噬率与吞噬指数越高。
　　3 小结与讨论
　　本研究从黄芪中提取黄芪甲苷，考察其对thp-1细胞活力和thp-1吞噬结核杆菌菌株h37rv的影响，结果显示在试验浓度范围内，黄芪甲苷能显著提高thp-1细胞活力和其吞噬h37rv的能力，且黄芪甲苷浓度越高其作用效果越强，可见黄芪甲苷有一定的免疫调节能力，这可能是因为黄芪甲苷能够提升巨噬细胞内次级溶酶体的体积与酶含量。试验发现黄芪甲苷的浓度对其作用效果的影响较大，黄芪甲苷浓度过低则作用效果较弱；浓度过高则有可能引起毒副作用，因此需要进一步研究以确定合理的用药浓度。
　　参考文献：
　　[1] 程红群. 结核病的流行趋势与防控策略[j].中华护理杂志，2007，42（7）：670-672.
　　[2] 刘 启，熊南山，程 斌.黄芪免疫药理学研究进展[j].中国中医药杂志，2005，2（6）：321-322.
　　[3] 聂紫雯， 魏强华. 黄芪免疫调节机制及临床应用进展[j].中国中医药信息杂志，2009，16（8）：103-105.
　　[4] 张 峰，高 鹏，彭俊华. 黄芪多糖及黄芪甲苷对巨噬细胞吞噬结核杆菌作用的研究[j].西北国防医学杂志，2006，26（6）：434-436.
　　[5] 高 鹏，张润玲，刘燕玲，等.荧光定量pcr方法探讨黄芪注射液对巨噬细胞吞噬结核杆菌的影响[j].第四军医大学学报，2005， 26（10）：894-896.