作者：陈天雷,王丹丽,张弦,范飞翔,黄尾全
【摘要】 目的 探讨中药紫草 治疗 和防止尖锐湿疣(ca)复发的机制。方法 结果 治疗组经紫草治疗后，ca皮损中bcl2、survivin、vegf的表达水平均明显低于治疗前(p<0.05)。治疗组的治愈率高于对照组(p<0.01)，复发率低于对照组(p<0.01)。结论 紫草可能通过下调凋亡抑制因子bcl2、survivin的表达，促进感染细胞凋亡，同时下调vegf的表达，抑制疣体供血血管的增生，起到清除病毒、使疣体缩小乃至消退的作用。
【关键词】 尖锐湿疣; bcl2; 生存素/survivin; 血管内皮细胞生长因子
abstract:objective to explore the mechanism of decoction of gromwell root in treatment and prevention of the recurrence of genital warts. methods 60 patients with genital warts were randomized into treatment group and control group,with 30 patients in each group. the patients in the treatment groups were treated with the decoction of gromwell root. the expression of bcl2,survivin and vegf from skin lesions of 30 patients with genital warts were detected by immunohistochemistry,the lesions were taken from the same site of the patients before and after the treatment with decoction of gromwell root. the therapeutic effects and followup results of the patients in the two groups were also compared. results after the treatment,the expressions of bcl2 and surviving,vegf from skin lesions after treatment were significantly lower than those before the treatment with the decoction of gromwell root (p<0.05). the recovery rate of the treatment group was higher than the control group,while the recurrence rate in the treatment group is lower than that in the control group (p<0.01). conclusion decoction of gromwell root could downregulate the expressions of bcl2,surviving,and vegf in skin lesions of genital warts,promote apoptosis of .the infected cells,inhibit the angiogenesis of the warts,to achieve the effects of scavenging virus,shrinking warts and even cleaning up warts.
key words:genital warts; bcl2; survivin ; vegf
尖锐湿疣(condyloma acuminatum，ca)是当今流行最广的性传播疾病之一，居性传播疾病第二位，仅次于淋病，并呈逐年升高的趋势[1]。WWW.11665.cOM该病传染性大，治疗后易复发，根治难度大，严重影响患者的身心健康。外用中药治疗 经济 、副作用小、无创伤，可较长时间大范围抑制病毒，在降低复发率方面取得较好疗效。紫草是研究较多且疗效较好的一种， 现代 药理研究已证实其体外具有较强的杀灭人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)作用[2]。本研究采用免疫组织化学技术，从细胞凋亡和血管生成角度观察紫草局部治疗ca前后皮损中凋亡抑制因子bcl2、生存素(survivin)和促血管生成因子——血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor， vegf)的变化，初步探讨紫草治疗和防止ca复发的机制。
1 材料与方法
1.1 临床资料
随机选取2009年1月至12月来我院皮肤性病科就诊的ca患者60例，均为首次发病，临床上符合ca的诊断标准[3]，单个皮损直径<1 cm，近1月内未接受系统治疗、2周内未接受局部治疗 ，无其他皮肤性病及系统性疾病。均为男性患者，年龄16～52岁，平均26.4岁。病程1周至1年不等。随机分为治疗组(紫草组)和对照组各30例，2组患者的年龄、病程、发病部位、疣体数目及大小比较差异无显著。
1.2 治疗方法
治疗组用中药紫草煎剂浸泡外洗治疗。紫草煎剂制作方法：中药紫草50 g加500 ml水浸泡1 h后武火煮沸，然后文火煮40 min，去渣取滤液。治疗前局部常规消毒、局麻，严格病理取材法取皮损标本，然后局部用紫草煎剂浸泡外洗，浸泡疣体处每天2次，每次15 min,连续2周后，再同前法留取标本，标本用10%(φ)甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续4～5 μm切片。同时观察疣体情况，予电灼去除全部疣体，伤口予外涂百多邦软膏，根据创面大小适量服用少量抗生素，术后2周皮损伤口基本愈合后，再予紫草煎剂浸泡1周，每日2次，每次15 min。
对照组30例，予电灼去除疣体，伤口外涂百多邦软膏，根据创面大小适量服用少量抗生素。
2组均随访1个月、3个月、6个月，观察复发情况，复发患者按上述2组治疗方案重复治疗相关疗程。
疗效判断标准：痊愈指疣体去除后随访6个月期间未发现原发部位或其他部位出现疣体皮损，复发指随访6个月期间无论是原发部位或是新发部位出现疣体皮损均视为ca复发[4]。
1.3 实验材料与试剂
抗人vegf克隆抗体(1∶100稀释)购自博士德公司，抗人bcl2克隆抗体购自dako公司，抗人survivin克隆抗体及二步法pv9000试剂盒均购自中杉金桥公司。
1.4 实验方法
免疫组织化学二步法主要过程：切片常规脱蜡水化，3%(φ)过氧化氢溶液10 min阻断内源性过氧化物酶，抗原修复液于微波炉中抗原修复10 min;加入一抗孵育，其中vegf、survivin 37 ℃孵育2 h，bcl2于4 ℃冰箱过夜;加二抗工作液a 液、b液分别37 ℃孵育20 min;dab显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。每次实验用已知阳性片作阳性对照，用pbs代替一抗作阴性对照。
1.5 结果判定
参照krajewska等[5]的评分方法先将黄色、棕黄色、棕褐色分别定为弱、中、强阳性表达强度，分别计为1～3分;再按阳性细胞的百分比将<1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、>76%分别记为0～4分;最后综合两部分得分。
1.6 统计学分析
采用spss13.0统计软件进行统计分析，计量数据用±s表示，采用t检验比较治疗前后ca皮损中bcl2、survivin、vegf表达的差异;率的比较用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 治疗效果及复发率比较
治疗组痊愈22例，治愈率73.33%,对照组痊愈13例，治愈率43.33%,2组治愈率比较差异有统计学意义(χ2=5.5 p<0.01)。治疗后随访6个月，治疗组复发8例，复发率为26.67%;对照组复发17例复发率为56.67%，治疗组复发率较对照组较低，两组差异有统计学意义(χ2=9.58，p<0.01)，治疗组疗效优于对照组。两组ca患者临床治疗效果及复发情况详见表1。
2.2 bcl2的表达
bcl2阳性反应定位于胞膜及胞浆，主要是胞浆。主要表达于ca组织表皮的基底层及棘层中下层，呈灶状分布，多呈棕黄色，少数呈棕褐色(见图1a)。经紫草 治疗 后表达bcl2的阳性细胞减少，主要是表达强度减弱，多呈黄色及棕黄色(见图1b)，与治疗前比较差异有显著性(p<0.05)(表2)。表1 两组ca患者临床治疗效果及复发情况比较
2.3 survivin的表达
survivin阳性反应定位于胞浆。表达于ca组织表皮的全层，呈灶状或弥漫性分布，以棘层为主，多呈棕黄色及棕褐色(见图2a)。经紫草治疗后表达survivin的阳性细胞减少，表达强度减弱，呈黄色及棕黄色(见图2b)，与治疗前比较差异有显著性(p<0.05)(表2)。
2.4 vegf的表达
vegf阳性反应定位于胞浆。表达于ca组织表皮的全层，呈弥漫性分布，多呈棕黄色，少数呈棕褐色(见图3a)。经紫草治疗后vegf的表达强度减弱，多呈黄色及棕黄色(见图3b)，与治疗前比较差异有显著性(p<0.05)(表2)。
3 讨论
ca是hpv感染引起的生殖器部位皮肤黏膜良性增生性疾病。其生长快，易复发，临床治疗困难。近年来研究发现ca皮损的表皮内众多凋亡抑制因子及促血管生长因子的表达明显高于正常人，致使皮损内细胞凋亡减少、真皮内血管增生，在ca的发生及转归中起重要作用。
细胞凋亡受众多相关基因的调控。bcl2是第一个被确认抑制凋亡的基因，能阻止多种因素介导的凋亡，处于凋亡调控的终末部分。survivin是近年来发现的最强的凋亡抑制因子，通过抑制caspase3、caspase7阻断细胞凋亡。研究显示ca皮损中survivin、bcl2的表达均高于正常上皮[6,7]。抑制survivin、bcl2等凋亡抑制因子的表达，将促使hpv感染细胞凋亡，进而达到清除病毒的目的。vegf是目前已知作用最强的一种促血管生成因子，是唯一能特异作用于内皮细胞的有丝分裂原，在肿瘤及正常血管生成的各个环节起重要作用[8]。体外实验证实皮肤组织中角质形成细胞是产生vegf 的主要来源，而角质形成细胞来源的vegf是真皮微血管内皮细胞特异性的有丝分裂原，可促进内皮细胞生长，在体内可诱导血管生成[9]。王鲁梅等[10]报道vegf在尖锐湿疣表皮中的表达数量及范围明显高于正常表皮，提示患者感染hpv后可能诱导角质形成细胞产生和分泌过量的vegf，促进真皮乳头层微血管增多及血管扩张，为异常增殖的细胞提供必要的养分和氧气，导致疣体迅速增生。恢复vegf平衡，进而抑制组织内新生血管形成，将可抑制疣体的增殖。
紫草性寒,味甘、咸,具有凉血、活血、清热、解毒之功效。近年来国内许多研究发现[11]紫草方在降低尖锐湿疣复发率方面优于西医治疗方法。本研究应用紫草煎剂浸泡外洗治疗ca,治愈率为73.33%,高于对照组的43.33%(p<0.05),复发率为26.67%,低于对照组的56.67%(p<0.01)，取得了较好的远期疗效。 现代 药理研究已证实在体外紫草水提物具有抗hpv作用[2]。
本研究观察紫草治疗前后ca皮损中bcl2、survivin、vegf的表达，结果显示治疗后3种因子的表达均明显减弱，说明紫草在体内治疗ca的机制可能是通过某种途径影响凋亡抑制因子的表达，促进感染细胞凋亡，同时抑制疣体供血血管的增生，切断疣体的营养来源，进而清除病毒、使疣体缩小乃至消退。但具体影响这些因子的机制还有待进一步研究。
【 参考 文献 】
[1] 王侠生,廖康煌. 杨国亮皮肤病学[m]. 2版：上海:上海医科大学出版社,2005：373-375.
[2] 符惠燕,邓远辉,冯怡,等. 紫草抗人乳头瘤病毒作用的研究[j]. 中药新药与临床药理,2005,16(4): 259-260.
[3] 吴志华.现代性病学[m].广东：广东人民出版社，1996：162-163.
[4] 李育林，王红梅.异维a酸联合干扰素治疗尖锐湿疣及预防复发的疗效比较[j].
