运脾中药复方制剂降低厌食大鼠下丘脑腹内侧区神经元的兴奋性

 【关键词】  运脾复方

    yunpi prescription reduces excitability of vmn neurons in anorexic rats

　　【abstract】 aim:  to explore the role of yunpi, a traditional chinese prescription, in reducing the sensitivity of the vmn neurons to the peripheral afferent signal in anorexia rats．methods:  the anorexic rat model was established by feeding rats with specially prepared forage for 1 week followed by  daily intragastric  administration of  liquid extract of yunpi prescription for 3 weeks. the extracellular recording from rat vmn was then conducted to characterize the responses of stimulating gastric vagal nerve and intravenous injection of sulfated cholocystokinin octapeptide (cck8) in the control, model and yunpi treated groups. results:  the duration of the vmn neuronal excitation to the gastric vagal nerve stimulation in model group was significantly longer than that in control group (p<0.05) and the number of ccksensitive neurons significantly increased with the decrease of stimulation intensity in model group compared with that in control group (p<0.05). however, there was no significant difference in the responses of vmn neurons to the stimulation of gastric vagal nerve and the cck administration between the yunpi treated group and the control group. conclusion:  yunpi prescription can reduce the sensitivity of vmn neurons to the negative feedback signal from the periphery and improve the appetite of the anorexia rats.

　　【keywords】 yunpi complex prescription; anorexia; ventromedial hypothalamic nucleus; stomach; vagus nerve; cholecystokinin

　　【摘要】 目的： 证实运脾中药复方儿宝颗粒降低厌食大鼠下丘脑腹内侧核（vmn）神经元对外周传入信号的敏感性. 方法： 用特制饲料喂养大鼠1 wk制备厌食模型，再用运脾复方灌胃治疗3 wk，然后用细胞外记录法，记录大鼠vmn神经元的自发放电，观察其对电刺激胃迷走神经、静脉注射八肽胆囊收缩素（cck8）的反应，比较对照组、模型组和治疗组3组间的差异. 结果： 模型组大鼠vmn神经元对胃迷走神经刺激的兴奋性反应时程延长（p<0.05），刺激强度降低（p<0.05），这些迷走兴奋的vmn神经元对静脉注射cck的敏感率也增加（p<0.05）；而治疗组大鼠vmn对胃迷走神经刺激和静脉注射cck的反应与正常组无显著差异. 结论： 运脾复方儿宝颗粒能够降低vmn神经元对外周传入的摄食负反馈信号的敏感性，从而达到促进食欲的目的.

　　【关键词】 运脾复方；厌食；下丘脑腹内侧核；胃；迷走神经；胆囊收缩素

　　0引言

　　近20年的临床实践证实运脾复方儿宝颗粒治疗婴幼儿厌食有可靠疗效［1］. 其机制研究表明，该复方能在外周水平上调节与摄食控制相关的多种因素［2］，如促进胃肠道蠕动、增强消化酶的活性、促进小肠吸收功能、调节胃肠道激素水平等，而我们近年来的研究结果表明，儿宝颗粒还能在中枢水平上影响摄食行为的控制［3-4］. 我们通过观察厌食大鼠下丘脑腹内侧核神经元（ventromedial hypothalamic nuclear, vmn）对胃迷走神经刺激和静脉注射cck的反应，进一步分析了运脾复方对vmn神经元兴奋性的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　日龄35～40d的sd大鼠45只，体质量（60±10）g（第四军医大学实验动物中心提供），随机分为对照组、模型组和治疗组，每组15只. 所有动物均单笼饲养，自由进食水.
 
　　1.2方法

　　1.2.1模型制备和药物治疗按文献方法制做厌食大鼠模型［5］. 即用正常鼠饲料喂养对照组大鼠，用特制饲料喂养模型组和治疗组大鼠，每日09:00记录每只大鼠的日摄食量和体质量. 1 wk后特制饲料喂养的大鼠日摄食量下降30%以上，体质量下降15%以上，表明模型制备成功. 从实验第8日开始，治疗组大鼠用运脾复方儿宝颗粒浸膏（第四军医大学科研药厂提供，药物组成苍术、陈皮、山　　　楂、白芍，每毫升含生药1.5 g）灌胃，1次/d，剂量为37.6 g/kg(为临床2倍等效量)，同时给予对照组和模型组大鼠等容积生理盐水灌胃，连续3 wk.
 　
　　1.3胃迷走神经刺激和vmn神经元自发放电的记录实验第28日晚禁食，次日用细胞外记录法观察大鼠vmn神经元对刺激胃迷走神经和静脉注射cck8的反应. 手术步骤：经大鼠腹腔注射乌拉坦（0.8 g/kg）和α氯醛糖（65 mg/kg）混合麻醉剂，麻醉后施行颈外静脉插管术，以备追加麻醉剂、注射cck8（10 g/kg，美国sigma公司产品）和生理盐水. 沿左肋弓切开腹腔，分离胃迷走神经前干与后干，挂于钩状双极刺激电极以备刺激. 缝合腹腔，用电热板维持动物体温于(37.0±0.5)℃. 然后，将动物固定于脑立体定位仪上，施第4脑室脑脊液引流. 依据paxinos和waston鼠脑立体定位图谱［6］，于vmn（a -2.3~-2.8 mm, l 0.5~1 mm, h 8~9 mm）上方开颅（直径约1.5 mm）.

　　以负相矩形双脉冲（100~500 μa, 0.5 ms,100 hz）刺激胃迷走神经干，用充以含10 g/l滂胺天蓝的0.5mol/l醋酸钠溶液的玻璃微电极（直流阻抗5~10 mω）细胞外记录vmn神经元单位放电. 神经元的放电信号经放大器放大后输入窗口甄别器，触发窗口甄别器输出的标准矩形脉冲（5 v, 1.0 ms），通过模/数转换器输入计算机进行实时数据分析. 由计算机采集的神经元放电信号自动生成刺激前后时间直方图，分析细胞对刺激胃迷走神经（采样间隔2 ms，每次采样800点，重复采样100次）和静脉注射cck（采样间隔1 s，每次采样900点，采样1次）的反应. 比较刺激后反应时间段内（刺激后窗口）神经元的放电频率与刺激前相同时间段内（刺激前窗口）神经元的基础放电频率，如果刺激后窗口内的放电频率降低到刺激前窗口内基础放电频率的30%以下，或增加到200%以上，则认为该细胞对刺激产生了抑制或兴奋反应.

 

 
　　1.4组织学定位每次实验结束时，用阴极电流（20 μa, 10 min）将玻璃微电极内的滂胺天蓝染料微量渗析到电极尖端的记录点，然后取脑固定. 1 wk后用冰冻切片机制备80 mm厚的脑切片，检查记录点位置（图1），凡实际记录点偏离vmn者，所获数据弃之不用.   sd大鼠前囟后

　　2.56 mm横切面，上方箭头指示电极尾部痕迹，下方箭头指示电极记录位置处于vmn区域.

统计学处理:  计量资料用x±s描述，计数资料用构成比描述. 用spss10.0统计软件进行数据处理. 图2资料用重复测量单因素方差分析，计数资料的组间比较用χ2检验，p<0.05认为组间差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.13组大鼠日摄食量在实验过程中（28 d），3组大鼠日平均摄食量变化趋势不同（p<0.05）；实验第1~7日内，模型组与治疗组大鼠日平均摄食量较对照组下降快，表明造模成功. 经儿宝颗粒治疗后，治疗组日平均摄食量上升较快，模型组日平均摄食量上升较慢（图2）. 表明运脾复方儿宝颗粒有促进食欲的作用.

　　2.23组大鼠vmn神经元对刺激胃迷走神经的反应3组大鼠共记录328个vmn神经元，其中对照组106个，模型组110个，治疗组112个. 胃迷走神经刺激引起的vmn神经元反应类型有兴奋性和抑制性反应两种，即抑制性反应（图3a）和兴奋性反应（图3b），但以兴奋性反应为主. 对照组、模型组和治疗组的vmn神经元对刺激胃迷走神经的反应性无显著性差异（p>0.05，表1）. 3组大鼠抑制性反应的vmn神经元反应潜伏期、反应时程和刺激强度亦无显著性差异（表2）. 但是，模型组vmn神经元的兴奋性反应时程明显高于对照组（ p<0.05）和治疗组(p<0.05)，其所需的刺激强度却显著低于对照组(p<0.05)和治疗组( p<0.05). 这就使模型组大鼠vmn神经元兴奋性反应的反应时程显著大于其抑制性反应的反应时程（p<0.05），前者所需刺激强度却显著小于后者（p<0.05）. 而在对照组和治疗组，vmn神经元的反应潜伏期、反应时程和刺激强度在兴奋性反应和抑制性反应之间无显著性差异.表1vmn神经元对刺激胃迷走神经的反应性［略］表2胃迷走神经刺激引起的大鼠vmn神经元的反应特征（略）

　　2.23组大鼠vmn神经元对静脉注射cck的反应我们对自发放电比较稳定的vmn神经元（包括对胃迷走神经刺激有反应和没有反应的细胞）做了cck敏感性测试，如果被检测细胞对静脉注射cck呈现出特异且显著的兴奋性反应，而对生理盐水不出现反应，则认为该细胞为cck敏感神经元. 在对胃迷走神经刺激无反应的vmn细胞中,各组间cck敏感神经元比例无显著性差异（表3）. 而在对胃迷走神经刺激有反应的vmn神经元中，模型组cck敏感神经元明显高于对照组(p<0.05)和治疗组(p<0.05).表33组大鼠vmn神经元的cck敏感性测试个数(略)

　　我们在7只大鼠上（正常组2个，模型组2个，治疗组3个）发现切断胃迷走神经显著衰减静脉注射cck引起的vmn神经元兴奋性反应（图2cd）.

　　2.4组织学经组织学检查，对胃迷走神经刺激有反应的神经元以及对静脉注射cck敏感的神经元记录位点散在分布于vmn中.

　　3讨论

　　运脾复方儿宝颗粒选用轻清之剂调和脾胃，既不用克削通导之药，也不用呆补滋腻之品，关键在“调和”，其促进食欲的作用机制应是协调机体各系统间的功能平衡，而不仅仅是对外周或中枢个别因素的孤立影响. 本研究着眼于摄食中枢神经元活动与外周摄食因素间的信息联系，观察了厌食大鼠vmn神经元对胃迷走神经刺激和血中cck浓度这两个重要的外周抑食因素的反应，从而探讨运脾法促进食欲的整体作用机制.

　　vmn是摄食控制环路中的一个重要核团，因其显著的抑食作用被称为饱中枢［7］. 胃肠道迷走神经是外周摄食信息传递入脑的主要通路. 胃迷走神经传入纤维可将摄食负反馈信号传入vmn，vmn再通过胃迷走神经传出纤维抑制胃肠运动，终止摄食行为［8-9］.

　　本研究发现模型组大鼠vmn神经元兴奋性反应的反应时程显著大于对照组和治疗组，而所需刺激强度却显著低于后两者. 这一结果表明模型组大鼠vmn神经元更容易被胃迷走神经传入信号所激活，提示其接受到的摄食负反馈信号比另外两组强烈. 这可能是模型组大鼠摄食量下降的主要原因，同时也提示运脾治疗有效地减弱了模型大鼠vmn神经元对胃迷走神经刺激的兴奋性反应，使神经元产生兴奋性反应的阈值增高，反应时程缩短.

　　cck是一种生理性饱因子，在进食过程中由小肠内分泌细胞释放入血，其血浓度在开始进食后20 min内达高峰，产生显著的抑食作用［8］. 本研究显示静脉注射cck能激活部分vmn神经元，大部分cck敏感神经元也对胃迷走神经刺激敏感，而切断胃迷走神经能显著减弱cck引起的vmn神经元反应. 这一结果提示cck血浓度升高产生的饱效应大部分是由胃迷走神经介导的. 实验结果显示模型组大鼠对胃迷走神经刺激敏感的vmn神经元中的cck敏感细胞数明显增多，提示厌食大鼠胃迷走神经介导的cck饱信号较对照组和治疗组强烈.

　　虽然vmn神经元接受胃迷走神经传入信息后主要通过其兴奋性反应发出饱信号，但本研究显示仍有约20%vmn神经元对胃迷走神经传入信号表现出抑制性反应，这些抑制性反应的神经元与兴奋性反应神经元的反应潜伏期、反应时程和刺激强度均无显著性差异. 我们推测，这一小部分抑制性反应的神经元，可能对兴奋性神经元的活动起拮抗作用，以便vmn能发出适度的饱信号，不致于过快和过分强烈地抑制进食. 但在模型组，这种平衡严重失调：模型大鼠vmn神经元兴奋性反应的时程显著高于抑制性反应的时程，而刺激强度显著低于后者. 这一现象同样提示厌食大鼠vmn发出的饱信号比正常大鼠强烈，而运脾治疗可能通过降低厌食大鼠vmn神经元对胃迷走神经刺激的兴奋性反应，从而协调vmn的整体活动，发出适度的饱信号.

　　我们研究结果表明，运脾复方儿宝颗粒通过降低厌食大鼠vmn神经元对胃迷走神经传入信息的敏感性，抑制厌食大鼠胃迷走神经传入信息对外周cck饱信号的介导，同时也协调了vmn兴奋性神经元和抑制性神经元的活动，这种直接针对机体自身调节规律的研究，可能更有利于揭示中医药疗效的整体机制.

　　【参考文献】

　　［1］汪受传，尤汝娣，郁晓维，等.  运脾方药治疗小儿厌食症的临床及实验研究［j］. 中西医结合杂志, 1991, 11(2): 75-78.

　　［2］万力生, 汪受传. 小儿厌食的中医药治疗现状与展望［j］. 南京中医药大学学报, 2000, 16(1): 63-64.

　　［3］杜永平，张月萍，胡三觉.  运脾复方对幼龄厌食大鼠lh, vmh神经元自发放电的影响［j］. 神经解剖学杂志，2001,17(2): 183.

　　［4］du yp, zhang yp, wang sc, et al. alteration in hypothalamus and periphery of braingut peptides in anorexic infantile rat model and the regulation by erbao granule［j］. world  j gastroenterol, 2001, 7(2): 275-280.

　　［5］汪受传, 张月萍, 陶勇, 等. 特制饲料喂养幼龄大鼠建立小儿厌食症模型［j］. 南京中医药大学学报，1999, 15(3): 148-150.

　　［6］paxinos g, waston c. the rat brain in stereotaxic coordinates［m］. san diego:  academic press, 1988: 29-31.

　　［7］张月萍，王建军. 摄食控制的神经体液机制研究进展［j］. 中国神经科学杂志, 2001, 17(4): 350-353.

　　［8］bray ga. afferent single regulating food intake［j］. proc nutr soc, 2000,59(3): 373-384.

　　［9］zhu jn,  zhang yp,  song yn, et al. cerebellar interpositus nuclear and gastric vagal afferent inputs reach and converge onto glycemiasensitive neurons of the ventromedial hypothalamic nucleus in rats［j］. neurosci res, 2004, 48(8): 405-417.