【摘要】  目的 对1个表型诊断为fⅻ缺乏的家系进行基因诊断。方法 检测先证者及其父母的血浆fⅻ:c，以其外周血单个核细胞中提取的基因组dna为模板，pcr扩增f12基因的全部外显子及其侧翼序列，pcr产物纯化后直接测序。结果 先证者及其父、母fⅻ:c分别是52.5%、78.6%、89%，直接测序结果提示先证者f12基因的第1外显子46位碱基即启动子上游-4位为t/t基因型，其父、母在该位点均为c/t基因型。该基因的其它编码序列和侧翼部位未发现有碱基改变。结论 f12基因的46 t/t多态性可能是导致先证者fⅻ缺乏的原因。

【关键词】  凝血因子ⅻ; 基因; 多态性; 家系

analysis of the coagulation factor ⅻ 46 c/t polymorphism in a pedigree and related literature review

　　chang dayu, ouyang jian , shao xiaoyan， zhou rongfu

　　(department of hematology, the affiliated drum tower hospital, nanjing university medical school, nanjing，210008, china)

　　abstract： objective to detect the gene mutation of a pedigree with coagulation factor ⅻ (fⅻ) deficiency. methods the peripheral blood samples were collected from the proband and his parents, and the plasma fⅻ:c were determined. all the exons and exonintron boundries of f12 gene were amplified with pcr and sequenced directly. results the activity of fⅻ were 52.5%, 78.6% and 89% for the proband, his father and mother, respectively. direct sequencing suggested that the proband was 46 t/t genotype in exon1, while both his parents were 46 c/t genotype in the same alle. no other base change was detected in f12 gene. conclusion the 46 t/t polymorphism of f12 gene might be the cause of fⅻ:c deficiency for the propositus.

　　key words： coagulation factorⅻ; gene; polymorphism; pedigree

　　凝血因子ⅻ (coagulation factorⅻ，fⅻ) 即hageman因子，是一种丝氨酸蛋白酶，主要由肝脏合成，参与内源性凝血途径的接触相激活。WWW.11665.cOM遗传性fⅻ缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，患者常表现为aptt延长但在临床上常无出血症状。本文对1个表型诊断为fⅻ缺乏的家系进行了基因诊断并就fⅻ在血栓形成中的作用进行文献复习。

　　1 资料与方法

　　1.1 家系资料 先证者，男，8岁，因"皮肤瘀点、瘀斑1周"就诊。患者无明显诱因出现右上肢皮肤瘀点、瘀斑1周，凝血象检查发现aptt 67 s，正常血浆混合试验aptt 32 s。患者父母非近亲结婚，家族中无类似病史。先证者及其父母肝功能检查正常。

　　1.2 血标本的采集、处理和dna制备 先证者及其父、母采集外周静脉血，枸橼酸钠抗凝，4℃ 4 000 r/min离心15 min后分离乏血小板血浆，分装后-80℃保存，用于凝血指标的测定。外周血单个核细胞按常规酚-氯仿法抽提基因组dna，用于pcr扩增。

　　1.3 血浆凝血功能的检测 aptt、pt、tt、fbg、fⅷ:c、fⅸ:c、fⅺ:c、fⅻ:c、fⅴ:c、fⅹ:c检测均采用法国stago公司试剂盒，在star automated coagulation laboratory血凝仪(stago公司)上进行测定。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

　　1.4 引物设计 根据fⅻ基因序列(genbank af538691)，参照文献[1]，应用primer 5软件共设计7对引物以覆盖该基因的全部外显子区域及其侧翼序列。引物由上海申能博彩生物科技有限公司产品合成。

　　1.5 pcr扩增 50 μlpcr反应体系包括：1×pcr缓冲液，1.5 mmol/l　mgcl2，0.25 mmol/l　dntps，引物终浓度0.5 μmol/l，500 ng　dna模板，2.5 u　taqdna聚合酶(pcr反应试剂均为上海申能博彩生物工程公司产品)。pcr反应在abi 2720 dna热循环仪上进行，反应条件：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，根据引物的不同分别在相应的退火温度退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃延伸10 min。pcr产物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，dl2000标记pcr产物大小。

　　1.6 pcr产物的纯化和测序分析 pcr产物进行割胶纯化(申能博彩pcr产物胶回收纯化试剂盒)，以制备测序模板，采用双脱氧链终止法在abi 3130测序仪上进行测序，用chromas 软件将测序结果与美国ncbi基因库公布的fⅻ基因序列(gene bank af538691)进行比对，寻找基因突变。发现基因突变的序列则反向测序予以证实。

　　2 结 果

　　2.1 表型检测 先证者凝血象检查显示aptt、pt、tt分别为67 s(参考值29～43 s)、12.6 s(11～14 s)、20.0 s(14～20 s)，fbg 3.2 g/l(2.0～4.0 g/l)，正常血浆混合试验aptt 32 s。各种凝血因子活性检测显示fⅷ:c 91%，fⅸ:c 94.0%，fⅺ:c 70.0%，fⅻ:c 52.5%，fⅴ:c 99.6%，fⅹ:c 82.1%(上述各因子活性正常参考值均为50%～150%)。其父亲aptt、pt、tt、fbg、fⅻ:c分别为37.5 s、11.7 s、18 s、3.8 g/l、78.6%，其母亲aptt、pt、tt、fbg 、fⅻ:c分别为35.9 s、11.6 s、17.5 s、2.2 g/l、89%。

　　2.2 fⅻ基因分析 对先证者fⅻ基因的所有14个外显子全部区域及其侧翼序列pcr产物进行测序，结果发现先证者在fⅻ基因第1外显子46位碱基即启动子上游-4位为t/t基因型。该基因的其它编码序列和侧翼部位未发现有碱基改变。其父亲、母亲的f12基因在该位点均为c/t基因型。测序结果见图1。

　　图1 fⅻ基因外显子1部分测序结果

　　3 讨 论

　　本文中的先证者因无诱因出现皮肤瘀斑，凝血象检查发现aptt延长而正常混合血浆试验能纠正，说明是内源性凝血途径的凝血因子活性缺乏;各种凝血因子活性检查提示仅fⅻ:c 52.5%为正常参考值的低值，其余凝血因子活性均在正常参考范围，显示是fⅻ:c降低导致aptt延长;基因测序提示fⅻ基因外显子1的第46位碱基为t/t基因型，其父、母则为c/t基因型，提示先证者的基因型为遗传所致。

　　fⅻ基因位于5号染色体(5q33qter)，编码由596个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，参与内源性凝血途径的接触相激活及纤溶酶原和激肽释放酶原的激活[2]。

　　研究表明，在fⅻ基因5'端非翻译区、atg起始密码子的上游4个碱基处的46 c/t基因型为多态性位点。当c被t替换后，产生了一个新的atg起始密码子，如图2所示。按照kozak理论[3]，一方面由于新的起始密码子所存在的部位不是最佳起始位点，基因调控使得核糖体蛋白跳过新的起始密码子而与原起始密码子相结合以启动转录;另一方面，由于从新的起始密码子开始转录后可在其后的第7个碱基处出现终止密码子(tga)而使蛋白转录终止，40s rna可在下游重新定位后开始新的转录过程。因此，从理论上推测，c被t替换后引起fⅻ活性减低。

　　图2 fⅻ基因外显子146c/t改变

　　kanaji等[1]的研究显示46位c或t对fⅻ基因的转录及其mrna的稳定性无影响，但与46c相比，46t时mrna的翻译显著降低，提示t/t基因型因显著降低fⅻ基因的翻译效能而减少fⅻ蛋白的合成;对健康人群血浆fⅻ水平的研究显示，46 c/c、c/t、t/t基因型时的fⅻ活性分别为170±38%、141±29%、82±19%，fⅻ抗原分别为176±27%、123±34%、61±11%，并发现该部位c/t多态性位点在东方人群中的等位基因频率为0.27/0.73，而在高加索人中为0.8/0.2。高加索人群的fⅻ活性较东方人为高可能就是这个多态性位点频率低的缘故。endler1等[4]对100例奥地利新生儿进行了研究，发现fⅻ基因46 c/c基因型占64%，c/t占29%，t/t占7%;对80例aptt延长的患者(排除凝血因子ⅷ、ⅸ和ⅺ等缺乏)进行的研究显示具有46 c/c等位基因的患者其fⅻ活性为1.17 u/ml 、c/t者为0.70 u/ml 、t/t为0.44 u/ml。bach等[5]对2 615例进行冠脉血管造影的德国人进行的46 c/t等位基因的检查，发现c/c基因型占57%、c/t基因型占38%,t/t基因型占5%，对fⅻ活性及活化的fⅻ水平的研究也证实了以上两个研究结果。故t/t基因型fⅻ的蛋白表达量显著低于c/c基因型fⅻ的蛋白表达量。国内王学锋等[6]在研究2个遗传性凝血因子ⅻ缺陷症家系fⅻ基因突变时也发现含有t/t基因型的先证者其fⅻ活性也较c/t基因型的为低。本文中的先证者经基因测序为46 t/t基因型，其父、母均为46 c/t基因型，故其fⅻ活性较其父、母的低。

　　尽管fⅻ在内源性凝血途径的启动环节中可能有重要作用，但其缺乏在临床上却无明显的出血，仅表现为aptt延长。相反，许多报道发现fⅻ缺乏与血栓栓塞性疾病的发病有关，认为fⅻ缺乏是血栓栓塞性疾病的发病风险之一。santamara等[7]对205例西班牙裔缺血性脑中风患者进行的fⅻ基因46 c/t多态性研究，发现46 c/c基因型者fⅻ活性为127.6%,c/t基因型为95.2%,t/t基因型为57.9%，46 t/t基因型在患者中占5.9%，正常对照占1.3%，认为46 t/t基因型是缺血性脑中风的风险因素;reuner等[8]对78例德国裔脑静脉血栓形成患者的病因研究，发现46 t/t基因型在患者中占16.7%，而正常对照仅占5.5%，提示46 t/t基因型是脑静脉血栓形成的独立危险因子。如果单从fⅻ缺乏的角度出发(即无论何种原因导致fⅻ缺乏)，有许多报道已发现类似的结果。halbmayer等[9]报道fⅻ缺乏与心肌梗死的发生、发展具有相关性。kuhli等[10]报道在≤45岁的视网膜静脉阻塞的患者中，fⅻ缺乏与其发病具有高度相关性。pauer等[11]报道fⅻ缺乏与原发性习惯性流产具有高度相关性。fⅻ缺乏易致血栓形成的机制可能与fⅻ通过直接及间接途径激活纤溶系统、导致纤维蛋白溶解有关[12]。fⅻ活性减低，则不能有效激活纤溶系统，易致血栓形成。

　　但是，也有不支持fⅻ易致血栓形成的报道，oguchi 等[13]报道ffⅻ基因46 c/t多态性与冠心病、静脉血栓栓塞性疾病、中风等无相关性。renn等[14]报道在fⅻ缺乏的小鼠模型中，动脉血栓形成被明显削弱，但没有过度出血表现;kleinschnitz等[15]报道fⅻ缺乏或抑制fⅻ活性可使实验小鼠的脑缺血损伤得到改善，说明fⅻ对于生理状态下的凝血过程并未发挥作用，只是选择性地作用于病理状态下的血栓形成。如果对fⅻ进行人为抑制，则可以为动脉血栓形成提供一种新的预防治疗措施，且没有出血风险[16]。

　　有关fⅻ缺乏导致的上述矛盾的临床和实验现象需要更多的资料、更深入的研究来逐步澄清，并为fⅻ缺乏的治疗提供更可靠的依据。

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