本实验表达的his-fima融合蛋白主要用于后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，因此需求量较大，而且不用考虑靶蛋白是否具有活性。本实验所表达的his-fima融合蛋白主要位于包涵体中，这种以包涵体形式表达的蛋白很稳定，不易被降解。这样在下一步实验纯化fima蛋白时，可以在变性条件（使用变性剂8m尿素或者6m的胍盐酸）下溶解包涵体，以便于使用co2+柱亲和层析得到纯化的靶蛋白。
本实验所使用的大肠杆菌bl21(de3)plyss所带plyss具有氯霉素抗性。在将重组质粒和空质粒转化入宿主菌时，不需要使用iptg进行蓝白筛选，因为pet-15b vector 含有氨苄青霉素抗性基因，转化了重组质粒和空质粒的bl21(de3)plyss同时具有氯霉素和氨苄青霉素抗性，而未转化的菌珠只有氯霉素抗性，这样就可以使用氨苄青霉素来对转化菌进行筛选。
本实验用本课题组前期构建的fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima，在大肠杆菌bl21(de3)plyss中诱导表达后，fima基因得到正确表达。
4 实验二 fima蛋白的纯化与鉴定
4.1 实验材料与仪器
4.1.1 菌珠
携带有pet-15b vector和pet-15b-fima的大肠杆菌bl21(de3)plyss：实验一获得。
4.1.2 主要试剂
1）bca法蛋白定量试剂盒：碧云天公司
2）talon纯化试剂盒：clontech laboratories,inc,usa
3）其他：同实验一
4.1.3 实验仪器
1）宝特elx-800酶标仪：宝特仪器有限公司
2）其他：同实验一
4.2 实验方法 4.2.1 样品制备
按照talon纯化试剂盒操作说明书制备样品，步骤如下：
1）在转化了质粒pet-15b-fima的lb固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，接种于5 ml amp+(100 μg/ml)的lb培养液中，37℃振摇过夜。wWw.11665.com
2）将5 ml过夜菌转接于500 ml lb(amp+)培养液中，37℃振摇4 h；加入iptg致终浓度为2 mmol/l ，37℃振摇3 h。
3）4℃，5500 r/min离心20 min收集细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃保存。
4）用buffer a（ph 7.0）重悬细胞沉淀物，每25 ml细胞培养物使用2 ml缓冲液。
5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。
6）4℃，10000～12000 r/min离心20 min以去除不溶性杂质。
7）小心的转移上清液到一个干净的离心管，不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。
4.2.2 分批/重力流柱子纯化fima蛋白
按照talon纯化试剂盒操作说明书进行，步骤如下：
1）彻底重悬talon树脂。
2）快速转移3 ml树脂悬液入一个无菌的离心管，700 g离心2 min，弃上清。
3） 加入10倍柱床体积的buffer a（ph 7.0），小心混匀以平衡树脂，700 g离心2 min，弃上清。
4）重复步骤3。
5）加入4.2.1所制备的样品。
6）室温下，小心搅拌上一步所得混合液20 min，700 g离心5 min。
7）小心移除尽可能多的上清液，注意不要触碰到沉淀在离心管底的树脂。
8）用10～20柱床体积的buffer a（ph 7.0）冲洗树脂。室温下，小心搅拌悬液10 min，以达到更彻底的冲洗效果，700 g离心5 min，弃上清。
9）重复步骤8。
10）加入1倍柱床体积的buffer a（ph 7.0），重悬混合。
11）转移树脂到一个2 ml的重力流层析柱中，缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部，该过程中要确保树脂柱床中不能有气泡进入。
12）用五倍柱床体积的加入了8 mm的咪唑的buffer a（ph 7.0）冲洗柱子。
13）加入5倍柱床体积的buffer b洗脱，按每500 μl一份来收集洗脱产物。
14）用sds-page的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。
15）将含有纯化蛋白的洗脱液以buffer c稀释后，置于透析袋中，在4℃搅拌条件下，梯度透析：
4 m尿素→2 m尿素→1×pbs＋1 m nacl→ l ×pbs+0.5 m nacl
→1 ×pbs →0.5×pbs→ddh20
16）将透析好的蛋白质留出20 μl用于蛋白含量测定，其余蛋白质冻干后做好标记置于－70℃保存。
buffer a（ph 7.0）：
50 mm na3po4
&, , nbsp; 8 m urea(尿素)
300 mm nacl
buffer b（ph 7.0）：
45 mm na3po4
7.2 m urea(尿素)
270 mm nacl
150 mm 咪唑
buffer c（ph7.0）：
100 mm nah2po4
10 mm tris-cl
8 m urea(尿素)
4.2.3 fima蛋白含量测定
按照bca法蛋白定量试剂盒操作说明书操作，步骤如下：
1）使用时将solution a摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution a加1体积
solution b（50:1）配制适量bca工作液，充分混匀。bca工作液室温24小时内稳定。
2）完全溶解蛋白标准品(5 mg/ml bsa)，取40 μl，用pbs稀释至200 μl ，使终浓度为1 mg/ml 。
3）将稀释后的蛋白标准品(1 mg/ml bsa)按0，5，10，15，20，25，30，35 μl
分别加到96孔板的样品孔中，用pbs将所有标准品补足到40 μl 。
4） 将蛋白样品10 μl加到96孔板的样品孔中，做好标记 ，用pbs稀释到40 μl 。
5）各孔加入200 μl bca工作液，轻轻用加样枪吹打混匀（注意不要弄出气泡影响读数），37 ℃放置50分钟。
6）冷却到室温后，用酶标仪测定a562的值。
7）根据标准曲线 计算 出样品中的蛋白浓度。
8）重复实验两次，取平均值。
4.2.4 western blot 鉴定纯化的fima蛋白
称取适量纯化的his-fima融合蛋白进行12％的sds-page，以iptg诱导后的bl21(de3)plyss全菌作为对照，电泳结束后将凝胶切取所需条带部分进行western blot，具体步骤如3.2.6中所示。
4.3 结果
4.3.1 fima蛋白的纯化和复性
原核融合表达产物以包涵体的形式存在，经样品制备，buffer b溶解，过co2+亲和层析柱，用洗脱buffer c洗脱，收集管中的洗脱液，取5 μl加入等体积的2×sds凝胶加样缓冲液（loading buffer），煮沸10 min，离心后取上清进行sds-page分析，结果（图4.1）示经洗脱buffer c洗脱后，洗脱液中基本不含杂蛋白，经这样的纯化过程，可以除去菌体蛋白，得到被纯化的6×his-fima融合蛋白。
纯化后的融合蛋白经buffer c稀释后进行梯度透析，以去除尿素等变性剂使蛋白复性。复性完毕的蛋白质做好标记，置于－70℃保存。
图4.1 洗脱蛋白的12% sds-page电泳分析
1：pet-15b-fima /bl21(de3)plyss；2-18：洗脱液中的蛋白
m：预染蛋白质markerⅲ
4.3.2 fima蛋白定量结果
根据回归曲线（图4.2）算出fima蛋白样本蛋白浓度为0.96mg/ml，数据见表4-1，4-2。这个结果说明，经co2+亲和层析，得到的蛋白质的浓度很高。
图4.2 蛋白标准曲线
表4-1 蛋白质标准曲线数据
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白质量(μg)
0
5
10
15
20
25
30
35
bca工作液(μl)
200
200
200
200
200
200
200
200
第一次结果（a 562 ）
0
0.117
0.197
0.285
0.336
0.408
0.455
0.524
第二次结果（a 562 ）
0
0.121
0.195
0.286
0.336
0.411
0.457
0.522
平均吸光度（a 562 ）
0
0.119
0.196
0.286
0.336
0.410
0.456
0.523
表4-2 蛋白样品吸光度值
吸光度a 562 a
吸光度a 562 b
平均值
fima
0.196
0.190
0.193
4.3.3 western blot结果
融合表达的目的蛋白his-fima带有his标签，因此，6×his-fima表达产物经sds-page后，转移至硝酸纤维素膜，以鼠抗6×his tag单克隆抗体为一抗，采用山羊抗鼠的种属特异性抗体为二抗，ecl底物化学发光试剂盒显色，在x线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与bl21(de3)plyss全菌诱导表达后相应蛋白位置一致（图4.3）。western blot结果进一步证明纯化的蛋白为his-fima融合蛋白。
1 2
fima蛋白
图4.3 纯化产物的western blot鉴定
1：全菌（未纯化）；2：纯化产物
4.4 讨论
在物种进化过程中，为了适应各种不同的生物学功能，蛋白质的结构也变得复杂多样，致使它们的理化特性也大不相同，因此难以使用统一的纯化流程。为此，根据蛋白质的物理特性不同，开发了一系列的纯化方法。其中最为快捷、简便的是亲和色谱法，该方法具有更多选择性，而且只需一、两步即可纯化出目的蛋白质。然而还有很多蛋白质的物理特性没有被充分了解，或者没有找到一些可用于纯化的强结合特性。对于这些问题，解决的方法之一是在目的蛋白质的氨基酸上融合纯化标签，构建一个可以使用普通方法进行纯化的重组蛋白质。
本实验所用原核表达载体pet-15b在大肠杆菌中表达目的蛋白时，是一种融合表达的方式。在载体pet-15b中，t7 rna聚合酶启动子与多克隆位点之间有编码6个组氨酸的核苷酸序列。本课题组前期实验pmd18-t-fima双酶切切出的目的基因片段插入到pet-15b多克隆位点中时，插入片段中的fima基因与编码组氨酸的核苷酸构成了融合基因，当对此融合基因进行表达时，就获得了融合蛋白6×his-fima蛋白。
在对融合蛋白进行纯化时，我们应用固定化金属螯合亲和层析技术（imac）。imac通过基团专一性亲和技术来分离蛋白质。其理论基础是氨基酸侧链可与固定化金属离子发生可逆性的相互作用。不同的金属离子可以吸附不同的氨基酸侧链。最为人熟知的是含组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链的蛋白质可以与固定化的过渡态金属离子结合。
实验中选用美国clontech实验室的talon钴离子树脂进行亲和层析。talon钴离子树脂属于imac树脂，以钴作为螯合金属，用来纯化带有组氨酸标签的重组蛋白质。t alon钴离子树脂对于含组氨酸标签的蛋白质的吸附具有极高的选择性，对宿主蛋白的亲和性极低[119]。实验中，当按照说明书处理过的样品经过talon钴离子树脂时，没有非特异性蛋白质结合，避免了蛋白质洗脱前繁琐的洗涤过程，大大的节省了实验时间。多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露6×his标签的6×his-fima融合蛋白能结合于固化co2+树脂，用适当缓冲液冲洗去除其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱就可以回收靶蛋白。由于咪唑的结构和组氨酸侧链相同，实验过程中，在洗脱缓冲液中加入了咪唑，这样就可以竞争性地将吸附在树脂上的含组氨酸标签的fima蛋白洗脱下来。
组氨酸可以高选择性地结合某些金属离子，在生理ph条件下，组氨酸的咪唑氮 电子 云可与过渡态金属的外层电子轨道形成共价键。尽管在一般条件下，只有2～3个组氨酸可以与过渡态金属结合，但是在有强变性剂，比如胍盐（尿素）存在时，则可有6个组氨酸与之稳定结合。这就是常说的6×his标签。在实验一中将重组质粒pet-15b-fima在大肠杆菌中进行融合表达时，得到的融合蛋白主要以不溶形式存在于包涵体中。在制备样品时，溶解包涵体的缓冲液中加入了8m的尿素，在用钴离子树脂进行亲和层析时，洗脱缓冲液中含有7.2m尿素。在高浓度的变性剂尿素存在时，6×his标签中的六个组氨酸就可以与钴离子稳定结合，更进一步增强了钴离子树脂对fima蛋白的亲和力，减少了杂蛋白的吸附。
大肠杆菌中合成的融合蛋白通常都是极好的免疫原，可以产生针对靶序列的抗血清。但很多时候，靶序列附加标签会有不利后果，即可能丧失生物活性。目的蛋白只有从融合蛋白上切割下来，才能获得天然的具有生物活性的靶蛋白。6个组氨酸标记物仅增加蛋白分子量0.84 kda，在多数情况下对目的蛋白的结构和生物活性影响都较小，短小的组氨酸尾巴无免疫原性，因此，在后续实验中，将正确表达后用co2+柱纯化的fima蛋白给动物注射用以产生抗体时，无需预先去除组氨酸尾巴。
本实验将实验一的表达产物经co2+柱亲和层析，得到了带6×his标签的fima融合蛋白。
5 结论与展望
牙周致病菌侵袭牙周组织时，人体会通过免疫反应影响牙周炎的发生、 发展 。1925年，casto首先提出用免疫的方法防治牙周病，但由于龈下菌群的复杂性，使这一研究进展非常缓慢。随着对牙周炎病原菌的分离培养及对牙周炎致病菌的进一步认识，大多数学者把注意力投向pg这一重要的牙周炎致病菌，并研制出各种类型的牙周炎疫苗。目前关于牙周炎的免疫学研究主要包括主动免疫和被动免疫两个方面。但被动免疫疗效维持时间短又需要长期反复应用，而采用主动免疫则变得简单。主动免疫又分为灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗、基因疫苗等。
随着分子生物学技术的发展和成熟，重组载体减毒活疫苗得到越来越多的重视。重组载体减毒活疫苗是指用非致病微生物（细菌或病毒）作为载体呈递外源性抗原的一种减毒活疫苗。目前，细菌载体中研究的较为成熟的有沙门氏菌、卡介苗，其中沙门氏菌是最常用的细菌性载体，至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙型肝炎病毒、流感病毒和血吸虫等数十种病原微生物的外源基因在以沙门氏菌为载体的减毒活疫苗中获得了不同程度的表达[120]。
这类细菌性重组载体在应用上及技术上有几个显著的特点[120-121]：①制造成本低，可以很方便的大量使用；②使用于人体的途径接近正常感染，尤其是它可以在黏膜局部应用，这就可以诱导具有较好免疫保护作用的黏膜免疫反应；③其外源抗原基因的容量较大，可以携带较大的外源抗原分子；④剔除了许多致病菌产生免疫副反应的产物；⑤易于给药，给药成本也较低。这些优越性使细菌载体疫苗特别适合群体免疫，也适合于牙周病的预防与 治疗 。
研究重组载体减毒活疫苗，首先要确定其免疫原基因。近年来，随着分子生物学、免疫学、分子细菌学等学科的发展，pg 的fima基因已被克隆和测序，对其蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位及相应的编码基因片段已有了一定的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。
本课题组在前期实验中成功构建了fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima。在此基础上，本实验将此质粒在大肠杆菌表达系统表达后，经co2+柱亲和层析，得到了可用于免疫新西兰大白兔、获得多克隆抗体的fima蛋白。因此本实验所获得的fima蛋白为后续实验免疫兔、收集免疫血清而获得多克隆抗体，进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的疫苗（如基因工程活载体疫苗、多价联合疫苗）提供了实验基础。
6 全文 总结
本研究将本课题组前期实验构建的牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima在大肠杆菌bl21(de3)plyss中诱导表达后，经co2+柱亲和层析，得到以下主要实验结果：
1）经iptg诱导表达后，工程菌在sds-page上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约41kda），iptg浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当iptg浓度为2 mmol/l，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当iptg浓度为1 mmol/l，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。6×his-fima表达产物经sds-page后，转移至硝酸纤维素膜，x线片感光，在x线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pet-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。
2）表达产物经co2+柱亲和层析，sds-page上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kda）。6×his-fima纯化产物经sds-page后，转移至硝酸纤维素膜，x线片感光，在x线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与bl21(de3)plyss全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经bca法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的fima蛋白浓度为0.96 mg/ml。
本研究结果说明：用本课题组前期构建的fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima，在大肠杆菌bl21(de3)plyss中诱导表达后，经co2+柱亲和层析，可以得到带6×his标签的fima融合蛋白。这一结果，有助于今后从分子遗传学角度研究牙龈卟啉单胞菌菌毛基因结构与功能的关系和进一步认识其在牙周炎发病过程中的致病机理；同时，为后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，以进一步研制具有实用价值的、可预防牙周炎这一口腔常见疾病的免疫疫苗提供了实验基础。
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