原文作者：马荣群等

　摘要 为早期鉴定无融合生殖苹果砧木杂种实生苗，对青砧二号xm9组合的79株f，代杂种实生苗单株进行了ssr标记分析。结果表明，18株f1代杂种实生苗为母本与父本的有性杂种，其余单株均为母本的无融合生殖后代，3对ssr引物扩增出9种带型，其鉴定结果一致，且和杂种实生苗的田间表现完全一致；利用ssr鉴定体系对平邑甜茶xlu06、平邑甜茶xzh2、青砧二号×宁8、青砧二号×海红杂交组合f1代中有性杂种的鉴定结果也与田间表现一致。已建立的ssr体系可快速、准确、高效地鉴定早期无融合生殖苹果砧木f1代有性杂种，有性杂种检出率达100%。
 　　关键词 无融合生殖 苹果砧木 ssr鉴定 f1代 有性杂种
　　无融合生殖苹果砧木利用种子进行实生繁殖，具有繁殖效率高、后代整齐一致、不易传播病毒等优点。苹果砧木杂种实生苗有性杂种，一般根据表现相对稳定的花朵、果实等性状的表型差异进行鉴定，需要4～5年以上，且定植实生苗占用大量土地。如何准确、快速地鉴定出无融合生殖后代的有性杂种，是提高无融合生殖砧木杂交育种效率的关键步骤之一。ssr标记是一种稳定可靠的dna指纹技术。目前，国内利用ssr标记鉴定无融合生殖苹果砧木杂种实生苗的报道较少。笔者前期研究结果表明，与植物学特征鉴定、流式细胞术倍性鉴定相比，ssr标记可以快速地从无融合生殖苹果砧木杂交后代中鉴别出非母本类型（有性杂种）。本文在前期研究的基础上，利用ssr标记技术对青砧二号xm9杂交组合79株f1代杂种实生苗，以及平邑甜茶xlu06、平邑甜茶×zh2、青砧二号×宁8、青砧二号×海红杂交组合245株f。Www.11665.cOm代杂种实生苗进行早期鉴定分析，旨在有效地辅助苹果砧木杂交育种工作，提高育种效率，节约育种成本。[论文网] 
 　　1、材料与方法
　　1.1 供试材料
　　杂交试验于2008年在青岛市农业科学院苹果砧木资源圃进行，母本有青砧二号（malushupehensis）、平邑甜茶（mjus hupehensis），父本为m9（malus d0mestica）、lu06（malus prunif0lia）、zh2（malus micr0malus）、宁8（malus prunif0lia）、海红（malus prunif0lia）。2009年定植获得各杂交组合f.代杂种实生苗，共324株。
 　　1.2 ssr标记分析
　　2012年6月，分单株采集青砧二号xm9杂交组合f，代叶片79份（编号1～79），分单株采集平邑甜茶×lu06、平邑甜茶xzfe、青砧二号×宁8、青砧二号×海红杂交组合f1代叶片245份，同时采集相对应组合的亲本叶片，于-20℃贮存备用。叶片dna采用改良ctab法提取。ssr分析引物参考文献，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ssr-pcr扩增反应体系参考文献：反应体系10 μl（模板dna约10 ng、1.5 mm0l/l mgcl2、0.2 mm0l/l dntp、50mm0l/l kcl、ph值9.0的10 mm0l/l tris-hcl，正、反向引物各0.2μm0l/l、lu taq dna聚合酶）；pcr扩增程序：94℃预变性3 min，94℃30 s、52℃30 s、72℃45 s，循环35次，72℃延伸5 min。pcr扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，并银染显色后拍照记录。
 　　2、结果与分析
　　2.1 ssr多态性引物的筛选
　　以青砧二号和m9基因组dna为模板，按照ssr反应条件筛选引物，用70对ssr引物进行扩增筛选，46对能扩增出清晰稳定的条带，筛选率为65.71%。从中筛选到3对带型清晰稳定且在杂种f1代及青砧二号、m9亲本间具有多态性的引物，分别为ch02810、ch01807、ch01f09。
 　　2.2 ssr鉴定结果分析
　　选用引物ch02810对亲本青砧二号、m9及f，代杂种实生苗79份叶样dna进行ssr—pcr扩增，marker为分子量标准pucl8 dna/mspi，从中鉴别出表现偏父本带型或双亲互补带型的有性杂种18株，编号分别为4、5、8、11、20、30、31、46、51、52、56、58、62、67、75、76、77、78。引物ch02810在18株f，代有性杂种实生苗的扩增带型表现不同，其中4、5、31、46、52、62、78号单株表现为带型a，8、11、20、30、51、56、58、75、76、77号单株表现为带型b，67号单株则表现为带型c；其余61株杂种实生苗均表现为母本带型，为母本的无融合生殖后代（图1）。
 　　引物ch01807、ch01f09在亲本青砧二号、m9及f1代杂种实生苗的有性杂种鉴定结果与引物ch01810鉴定结果一致。引物ch01807扩增出的18株有性杂种表现为4种带型，4、5、8、11、20、31、52、56、75、76、77、78号12个单株表现为带型d，30、46、51、62号单株表现为带型e，58号单株表现为带型f，67号单株表现为带型g（图2）。引物ch01f09扩增出的18株有性杂种表现为2种带型，8、56、76、77号单株表现为带型h，其余14个单株表现为带型i（图3）。
 　　3对ssr引物在18株f1代有性杂种间共表现出了9种带型，其中引物ch02810表现a、b、c 3种带型，引物ch01807表现d、e、f、g 4种带型，而ch01f09表现h和i 2种带型，各种带型均部分携带双亲ssr位点信息。3对引物ssr标记相互验证的结果显示，以上18个携带不完全双亲ssr位点信息的单株均为有性杂种，且ssr鉴定结果和实生苗的田间表现完全一致。
 　　2.3 ssr鉴定体系在其他杂交组合中的应用
　　利用ssr鉴定体系对另外4个杂交组合的f1代杂种实生苗单株进行有性杂种鉴定，其中，平邑甜茶×lu06组合f1代杂种实生苗中鉴定出8个有性杂种单株，平邑甜茶xzh2组合f1代杂种实生苗中鉴定出1个有性杂种单株，青砧二号x宁8组合f1代杂种实生苗中鉴定出9个有性杂种单株，青砧二号×海红组合f1代杂种实生苗中则未检出有性杂种，全部为母本青砧二号的无融合生殖后代。以上亲本杂交组合f1代杂种实生苗单株室内ssr鉴定结果与田间调查统计结果完全吻合。
 　　3、小结与讨论
　　研究以苹果砧木青砧二号xm9杂交组合的79株f1代杂种实生苗为材料，利用ssr标记分析鉴定有性杂种，从中检出18株有性杂种，其余61株为母本的无融合生殖后代。所用3对ssr引物的鉴定结果一致，且ssr鉴定结果和杂种实生苗的田间表现完全吻合。利用该ssr体系对平邑甜茶xlu06、平邑甜茶×zh2、青砧二号×宁8、青砧二号×海红4个杂交组合的f1代杂种实生苗进行鉴定，有性杂种鉴定结果与田间表现一致。
 　　马荣群等研究表明，ssr标记在青砧二号×m9杂交组合的f1代有性杂种单株间的带型表现一致，均为双亲的互补带型。在本试验中，相同ssr体系在青砧二号xm9杂交组合f1代有性杂种株间出现了不同的扩增带型，而没有呈现ssr标记所具有的典型共显性遗传的扩增带型（即双亲ssr位点信息的完全叠加）。唐建民等的研究也表明，这种情况可能与苹果本身高度杂合的复杂遗传背景有关，导致有时ssr-pcr扩增结果不能共显性显现。
 　　总之，本研究利用ssr分子标记，快速、准确、高效地鉴定了无融合生殖苹果砧木杂交组合f1代实生苗，有性杂种检出率达100%，对于提高育种效率具有非常重要的意义。