原文作者：齐丹等

　摘要 采用srap分子标记方法对辽宁省绥中县地方梨品种秋白梨、绥中谢花甜、水红宵、粉红宵、洋红宵及8个秋白梨可能变异单株进行遗传多样性和亲缘关系分析。从100对srhp引物组合中筛选出9对引物组合，扩增条带数76条，其中多态性条带数43条，多态位点百分率为56.6%，具有较高的多态性；聚类分析将供试材料分为3组，遗传相似系数0.690～1.000。引物组合me2/eml、me4/eml、me4/em6、me7/eml可区分绥中谢花甜、粉红宵、水红宵、洋红宵、秋白梨及秋白梨单株1、2、4、7号；秋白梨1、2、4、7号在分子水平检测出变异。srap技术可有效地应用于梨的品种及芽变鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析。[论文网] 
 　　关键词 梨 种质 srap 鉴定 亲缘关系 辽宁 绥中
　　辽宁省绥中县是我国白梨主要产区之一，主要品种有秋白梨、绥中谢花甜、粉红宵、水红宵等。秋白梨是我国北方古老而优良的梨品种之一，在辽宁省绥中县已有近千年的栽培历史，长期生产栽培可能已经累积了许多自然变异类型。通过常规鉴定，发现绥中县境内一些秋白梨单株在果实形状、单果重、心室数、果心大小、褐变度、石细胞含量等方面存在差异，疑似为秋白梨的变异单株，其是否为遗传变异需要进行鉴定。srap（sequence-relatedamplifiedp0ly-morphism）是一种基于pcr的dna分子标记技术，具有操作简单快速、扩增稳定、不需要预知物种的基因组信息等特点，该方法已在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建、重要性状基因标记定位与克隆以及比较基因组学研究等众多领域得到广泛应用。wWW.11665.cOM本研究通过建立的梨srap-pcr反应体系，对5个绥中地方梨品种及8个秋白梨可能变异单株进行srap鉴定分析，从dna水平研究地方梨品种的亲缘关系，并对秋白梨可能变异单株进行遗传变异检验，为梨芽变选种提供可靠的方法和理论依据。
 　　1、材料和方法
　　1.1 试验材料
　　供试材料均采集自辽宁省绥中县，编号1～5为秋白梨可能的变异单株，6号为秋白梨原始品种，编号7～9为秋白梨可能的变异单株，编号10～13分别为绥中谢花甜、粉红宵、水红宵、洋红宵。2012年5月采集植株上的幼嫩叶片，称重分装后放在70℃超低温冰箱中保存备用。
 　　1.2 试验方法
　　1.2.1 基因组dna的提取
　　采用qiagen试剂盒法提取基因组dna，用0.7%琼脂糖凝胶检测dna的质量和完整性，放置于～20℃冰箱中保存备用。
　　1.2.2 srap标记分析与引物筛选
　　参照li等公布的序列，合成正向引物mel～10，反向引物eml～10，组成100对引物组合，由上海生工生物工程有限公司合成。srap-pcr反应体系参考张妤艳等的方法，并对退火温度进行优化，为54.3℃。pcr扩增仪型号为bi0-radc100thermalcycler。对100对srap引物组合进行2%琼脂糖凝胶筛选，筛选扩增稳定清晰的引物组合，对有差异引物组合重新扩增，产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
 　　1.3 数据统计与处理
　　根据各扩增片段的迁移距离，将同一引物组合的电泳结果中稳定出现的条带（无论强弱）的有或无分别赋值为1和0，统计后形成（0，1）矩阵，利用ntsys-pc2.1统计分析软件计算试验材料间的dice遗传相似系数，采用非加权组平均法（upgma）进行聚类分析，建立系统聚类图。
 　　2、结果与分析
　　2.1 dna扩增结果及多态性分析
　　共选出扩增条带清晰、多态性好的9对srap引物组合。9对引物组合对13份供试材料共扩增出76条清晰条带，其中多态性条带为43条，占总带数的56.6%，平均每对引物组合产生8.4条带和4.8条多态性带。不同引物组合扩增的dna片段大小为50～1000bp。引物组合me2/eml、me5/em7、me6/em3的扩增结果见图1。引物组合me2/eml扩增多态性比率最高（80.0%），引物组合me6/em5扩增多态性比率最低（0%）。引物组合me2/eml、me4/eml、me4/em6、me7/eml对供试材料有明显扩增差异带，可区分绥中谢花甜、粉红宵、水红宵、洋红宵、秋白梨及秋白梨单株1、2、4、7号。筛选出的9对引物组合3、5、8、9号秋白梨单株的扩增条带与6号秋白梨原始品种的srap带型均相同，未检测出变异；1、2、4号秋白梨单株与6号秋白梨原始品种在引物组合me2/eml、me4/eml、me6/em3上的srap扩增条带存在差异；与6号秋白梨原始品种的标准srap带型相比.有7对引物组合能对7号秋白梨单株扩增出特殊的srap条带。
 　　对扩增结果计算遗传相似系数，13份供试材料的遗传相似系数变化范围为0.690～1.000，平均值为0.850。秋白梨7号单株与6号秋白梨原始品种的相似系数为0.803，1、2、4号秋白梨单株与6号秋白梨原始品种相似系数分别为0.991、0.963、0.973，3、5、8、9号秋白梨单株与6号秋白梨原始品种相似系数为1.000。
 　　2.2 聚类分析
　　基于srap的扩增结果，用upgma法进行聚类分析，得到13份供试材料的亲缘关系树状图（图2）。以0.83的遗传相似系数为阈值，供试材料聚为3组：第1组为秋白梨原始品种6号和除了7号外的秋白梨单株；第2组为7号秋白梨单株、绥中谢花甜、粉红宵；第3组为水红宵、洋红宵。
 　　第1组又可以分为2个亚组，第1亚组为秋白梨单株1、3、5、8、9号和6号秋白梨原始品种；第2亚组为秋白梨单株2、4号。
　　3、小结与讨论
　　赵广等用srap分子标记成功地区分出了南果梨与南果梨红色变异系，以及考密斯梨及其色泽变异品种（系）。路娟等用8对srap引物组合的聚类分析结果揭示了45个樱桃品种间亲缘关系与地理分布以及来源相关。张四普等用600对srap引物组合对石榴的白花芽变进行鉴定，其中的1对引物组合成功地扩增出了1条稳定的差异片段。本试验采用srap分子标记方法对辽宁省绥中县地方梨品种秋白梨、绥中谢花甜、水红宵、粉红宵、洋红宵和秋白梨可能的变异单株进行遗传多样性和亲缘关系分析，9对srap引物组合共扩增出76条带，多态性条带有43条，多态位点百分率为56.6%，显示了较高的多态性。
 　　在7对引物组合的聚丙烯酰胺凝胶的结果中，7号秋白梨单株既有6号秋白梨原始品种的标准条带，也有其独特的条带，其发生的遗传变异最大，且在相似系数0.85处与绥中谢花甜、粉红宵聚在一起，推测其可能是自然杂交形成的新品种，并非芽变，其亲本有待于通过其他分子标记手段进一步鉴定。3、5、8、9号秋白梨单株与6号秋白梨原始品种相比，其遗传物质未发生改变；1、2、4号秋白梨单株与6号秋白梨原始品种srap鉴定存在差异，在dna水平上发生了变异。从果实性状上看，标准秋白梨果实为圆形、果皮黄色，平均单果重149.0g。1号秋白梨单株果实变异主要表现在果形为纺锤形；2、4号秋白梨单株果实变异主要表现在单果重和果形，2号单株果实倒卵形，平均单果重259.0g，4号单株果实为不正的扁圆形，平均单果重234.0g；7号秋白梨单株果实颜色发生变异，为红色。这些变异单株的发现和鉴定可为秋白梨新品种选育提供理论依据。