【摘要】 目的观察基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, sdf-1)在鸡卵清蛋白(ova)诱导小鼠哮喘模型中的表达，探索哮喘气道重塑的发生机制。方法40只雌性spf级c57bl/6小鼠，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法建立ova小鼠哮喘模型。两组动物于末次雾化结束后24h处死，取肺组织行病理切片，苏木精-伊红染色(he)观察肺脏的组织病理学变化;逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、免疫印迹法(western blot)、免疫组织化学(immunohistochemistry, ih)技术检测肺组织sdf-1的表达。结果①哮喘组支气管上皮细胞脱落、气道壁增厚，细支气管和血管周围有大量炎细胞浸润;②哮喘组肺组织sdf-1在rt-pcr、western blot及ih中均为阳性表达，而对照组则否。结论小鼠哮喘时肺组织分泌大量细胞趋化因子sdf-1，可能是哮喘气道重塑的重要因素之一。
【关键词】基质细胞衍生因子;哮喘;气道重塑
abstract: objectiveto study the expression of stromal-derived factor-1 (sdf-1) in the airway of mice with allergic asthma induced by ovalbumin (ova) so as to explore the mechanism of asthmatic airway remodeling.methodsforty female c57bl/6 mice of spf grade were randomly divided into asthma group and control group with 20 in each. mice were sensitized and challenged with ovalbumin to establish the asthmatic model. all the mice were killed 24 hours after the last aerosolisation. the paraffin embedded sections of lung tissues were stained with hematoxylin and eosin (he) for analyzing pathological changes. sdf-1 mrna extracted from lung tissues was assessed by rt-pcr while sdf-1 protein extracted from lung tissues was assessed by western blot and immunohistochemistry (ih).results① after repeated allergen challenge, obvious infiltration of inflammatory cells and proliferation of goblet cells and smooth muscles appeared in mouse bronchi. ② according to rt-pcr and western blot and ih results, the expression of sdf-1 was positive in asthma group but negative in control group.conclusiona large amount of sdf-1 is secreted in the lung tissues in asthmatic mice, which may be one of the critical factors in asthmatic airway remodeling.
key words: stromal-derived factor-1; asthma; airway remodeling
支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，而气道重塑则是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程。wWW.11665.Com基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, sdf-1)是由基质细胞产生的一种cxc型趋化因子。近年来研究表明，基质细胞衍生因子对组织或器官的创伤、炎症损伤修复起到了重要的作用。但是，sdf-1与哮喘相关性的研究目前还未见报道，我们就此进行了探讨。
1材料与方法
1.1药品与试剂鸡卵清蛋白(ova)ⅴ级(美国gbico公司);氢氧化铝干粉(郑州派尼化学试剂公司);pbs(美国gbico公司);sdf-1兔抗小鼠一抗(武汉博士德生物有限公司);过氧化物酶标记羊抗兔二抗(美国dako公司);ecl发光液(北京碧云天公司);兔抗小鼠内参β-actin(北京博奥森公司);免疫组织化学试剂盒(美国dako公司)。
1.2方法
1.2.1哮喘模型的制备小鼠哮喘模型实验参考文献[1]，略有变动。实验动物为40只雌性spf级c57bl/6小鼠(第四军医大学动物中心提供)，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法[1]构建哮喘模型：0、7、14d于小鼠腹腔内注射致敏液0.2ml/只(致敏液为每0.2ml pbs溶液内含10μg ova、20μg氢氧化铝)。于第21天开始0.5g/l浓度的ova生理盐水溶液雾化，每次30min，隔日1次，共计18次。对照组用空白pbs及生理盐水，余同模型组。两组动物于雾化结束后24h处死，取右肺于40g/l甲醛溶液中固定，石蜡包埋，用于病理观察及免疫组织化学(ih)检测;取左肺于液氮中保存，用于rt-pcr及western-blot测定sdf-1。
1.2.2rt-pcr法检测sdf-1的表达提取肺组织总rna，分光光度仪上定量及检测rna纯度，用两步法rt-pcr。sdf-1上游引物：5′-cactttc-actctcggtccac-3′，下游引物为：5′-ctgaag-ggcacagtttggag-3′，序列长度约500bp。pcr反应条件：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。rt-pcr产物以10g/l琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在gds-8000数码成像及分析系统上观察、拍照。
1.2.3western blot法检测sdf-1的表达左上肺组织用液氮粉碎及超声提取总蛋白后，每组取400μl总蛋白，加入等体积的2×sds凝胶加样缓冲液，100℃ 5min使蛋白变性;经120g/l sds变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转印至pvdf膜;50g/l脱脂奶粉封闭后，sdf-1兔抗小鼠一抗(1∶200)及兔抗小鼠内参β-actin(1∶200)孵育4℃过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2h后，ecl试剂进行检测，在flourchem fc2成像及分析系统中观察、拍照。
1.2.4免疫组织化学法检测sdf-1的表达哮喘组及对照组肺组织蜡块连续石蜡切片，经脱蜡至水后以0.3ml/l过氧化氢溶液浸泡10min，灭活内源性过氧化物酶;抗原热修复后以正常山羊血清封闭，分别加一抗即兔抗小鼠sdf-1抗体1∶200，4℃过夜;加生物素标记的二抗(羊抗兔igg 1∶200)，37℃，40min;加新鲜配制的二氨基联苯胺(dab)显色，苏木精复染细胞核，显微镜下观察5～10min，棕黄色染色为阳性信号。
1.3统计学分析应用spss16.0软件包行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，采用两样本t检验处理统计学数据，p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1小鼠的一般情况及肺组织病理学改变哮喘组小鼠经激发后，出现烦躁不安，呼吸急促，腹部翕动，易激惹;对照组小鼠行动敏捷，一般情况未见异常。哮喘组小鼠肺组织切片he染色可见，小鼠细支气管周围和血管周围有大量的淋巴细胞、单核细胞和多形核细胞浸润，并伴有上皮脱落，气道壁增厚。对照组病理切片无上述表现(图1)。图1小鼠肺组织的病理学改变fig.1 he staining of lung histological sections (he, ×100)a：对照组;b：哮喘组。
2.2rt-pcr琼脂糖凝胶电泳结果哮喘组于500bp处出现特异性扩增条带，与预期趋化因子sdf-1扩增片段一致;对照组无特异性扩增条带。正常肺组织几乎无sdf-1 mrna，哮喘时肺组织有sdf-1 mrna(图2、表1)。图2rt-pcr法检测两组小鼠肺组织sdf-1mrna的表达 fig.2 the expression of sdf-1mrna in asthmatic mouse lung tissues on rt-pcrm：蛋白分子量标准;1：哮喘组;2：对照组。表1两组小鼠肺组织sdf-1mrna的表达
2.3western blot化学荧光法的检测结果哮喘组于15ku处有特异性条带显像，与sdf-1蛋白分子质量一致;对照组无特异性条带显像。正常肺组织无sdf-1蛋白表达，哮喘肺组织表达sdf-1蛋白(图3、表2)。图3western blot化学荧光检测两组小鼠肺组织sdf-1蛋白的表达情况 fig.3 the expression of sdf-1 protein in mouse lung tissues on western blot表2两组小鼠肺组织sdf-1蛋白的表达
2.4免疫组织化学(sabc)法的检测结果哮喘组可见支气管上皮细胞破坏，支气管和血管周围有大量炎细胞浸润，支气管壁及周围大量细胞于胞质内出现棕黄色阳性信号;对照组无上述病理变化，无棕黄色阳性信号出现(图4)。图4小鼠肺组织sdf-1表达的ih化学检测fig.4 immunohistochemisty staining of lung histological sections (sabc, ×100)a：对照组;b：哮喘组。
3讨论
sdf-1是由基质细胞产生的cxc型趋化因子，有sdf-1α、sdf-1β，sdf-1γ三个亚型。cxc族细胞因子受体4(cxcr4)是目前所知的sdf-1的唯一受体。sdf-1基因5′末端存在丰富的gc序列，而tata序列则极少表达。sdf-1在各物种中有高度保守性，在人与鼠的sdf-1的氨基酸序列中有95%是相同的[2]。
支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，气道重塑是哮喘难以治疗的主要因素之一。因此，防止或减轻气道重塑也就成为防治哮喘的重要策略，是呼吸领域备受关注的热点问题。我们采用rt-pcr、western blot方法检测到哮喘肺组织高表达sdf-1。
进一步采用免疫组织化学方法，发现sdf-1蛋白质主要分布于支气管壁及周围细胞的胞质内。近年来研究发现，在多种组织损伤修复过程中均有sdf-1的参与。例如，当心[3]、脑[4]、肝脏[5]、肾脏[6]等组织器官损伤时，病灶内sdf-1的分泌量显著增加，促进了纤维组织增生和新生血管形成。在博来霉素诱导的肺间质纤维化小鼠模型中，肺组织高表达sdf-1与肺纤维化有密切关系[7]。气道重塑的本质是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程，因此我们推测：在支气管哮喘导致气道重塑的过程中，肺部损伤释放趋化因子sdf-1可能在支气管哮喘气道重塑中起重要作用。
现有的研究表明，sdf-1与组织损伤的修复有着密切的关联，但其是否在哮喘气道重塑中起到作用，还需要做大量的研究。希望以此为切入点，为治疗支气管哮喘、防止或减轻气道重塑寻找到新的、更为有效的方法。
【参考文献】
\[1\]temelkovski j, hogan sp, shepherd dp, et al. an improved murine model of asthma: selective airway inflammation, epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen \[j\]. thorax, 1998, 53(10):849-856.
\[2\]murdoch c. cxcr4: chemokine receptor extraordinaire \[j\]. immunol rev, 2000, 177:175-184.
\[3\]kucia m, dawn b, hunt g, et al. cells expressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood after myocardial infarction \[j\]. circulation res, 2004, 95(12):1191-1199.
\[4\]imitola j, raddassi k, park ki, et al. directed migration of neural stem cells to sites of cns injury by the stromal cell-derived factor 1alpha/cxc chemokine receptor 4 pathway \[j\].proc natl acad sci usa, 2004, 101(52):18117-18122.
\[5\]dalakas e, newsome pn, harrison dj, et al. hematopoietic stem cell trafficking in liver injury \[j\]. faseb j, 2005, 19(10):1225-1231.
\[6\]togel f, isaac j, hu z, et al. renal sdf-1 signals mobilization and homing of cxcr4-positive cells to the kidney after ischemic injury \[j\]. kidney int, 2005, 67(5):1772-1784.
\[7\]李文，吴东，梁标. 基质细胞衍生因子-1与肺纤维化关系的初步探讨 \[j\].
