作者:李明,陈伟强,胡太平,张丽蓉,蔡尤彪,古宏标
【摘要】 目的 研究穿心莲内酯对小鼠巨噬细胞氧化亚氮(no)、肿瘤坏死因子(tnfα)和白细胞介素6(il6)生成的影响。方法 培养小鼠巨噬细胞raw264.7,分别加入脂多糖(lipopolysaccharide,lps,终质量浓度1 μg/ml)和不同浓度的穿心莲内酯(终浓度1、10、50 μmol/l)进行干预,并设空白组和穿心莲内酯单独作用组作为对照。取培养24 h细胞上清,用griess法检测no产量;用elisa法检测tnfα、il6浓度。结果 与空白组比较,lps明显促进了raw264.7细胞no、tnfα、il6等炎症因子的生成;穿心莲内酯单独作用不影响炎症因子的表达,但穿心莲内酯能显著下调lps诱导的炎症因子表达,与lps组差异有显著性。结论 穿心莲内酯可明显降低lps诱导的巨噬细胞炎症因子表达,抑制炎症反应。
【关键词】 穿心莲内酯;巨噬细胞;炎症因子;内毒素
)abstract:objective to investigate the inhibitive effects of andrographolide on lipopolysaccharideinduced inflammation factors secretion in macrophage cells.methods a macrophage cell line raw264.7 cells were cultured in vitro,and treated with different concentration of andrpgrapholide in the presence or absence of lipopolysaccharide (lps). the production of inflammatory factor nitric oxide (no),tumor necrosis factorα(tnfα) and interleukin6 (il6) in the supernatant was measured by griess reagent and elisa,respectively.results after stimulated with lps,the content of no,tnfα and il6 were markedly upregulated. pretreated with andrographolide significantly inhibited lpsinduced inflammation factors expression levels,which was statistically significant compared with lps group(p<0.05).conclusion these results indicated that andrographolide might effectively blocks inflammation by downregulating production of no,tnfα and il6.
key words:andrographolide;macrophage cells; inflammation factor; lipopolysaccharide
目前,炎症在心血管疾病、肿瘤中的促进作用日渐受到重视,抑制炎症反应防治心血管疾病及肿瘤成为研究的重点[1-2]。wWW.11665.cOm穿心莲为爵床科植物穿心莲属植物穿心莲干燥地上部分,作为常用中药,具有清热解毒、凉血消肿等功效。穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分,有研究表明,穿心莲内酯有显著的抗炎活性,能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加,还对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型有明显的抗炎作用[3]。炎症反应时,巨噬细胞在细菌及其内毒素的刺激下,分泌大量的炎症因子,如氧化亚氮(no)、tnfα和il1β等,这些炎症因子又可以进一步活化巨噬细胞,形成恶性循环,加重炎症反应。本研究通过观察穿心莲内酯对no、tnfα和il1β等炎症因子表达的影响,探讨其抗炎活性。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
穿心莲内酯(四川广汉市维康植化有限公司);细菌内毒素(lps,e coli serotype 055:b5,美国sigma公司);no检测试剂盒(南京建成生物公司);tnfα、il6 elisa检测试剂盒(美国r&d公司);胎牛血清(杭州四季青公司);dmem培养基(美国gibco公司);酶标仪(美国biorad公司)。
1.2 细胞培养及干预实验
小鼠巨噬细胞raw264.7细胞由本室保存。用完全dmem培养基(含体积分数10%胎牛血清、质量浓度100 u/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素),体积分数5%co2,37 ℃条件下传代培养。取生长状态良好的raw264.7细胞,质量分数0.25%胰酶消化,用dmem培养基调整细胞浓度为1×106/ml,接种到24 孔培养板内,待细胞生长至80%融合后,加入不同浓度的穿心莲内酯(终浓度分别为1、10、50 μmol/l)孵育1 h,然后加入lps(终质量浓度1 μg/ml)进行刺激。实验分组:正常对照组、穿心莲内酯单独作用组、lps组和穿心莲内酯加lps组。
1.3 no浓度测定
细胞加入刺激物后培养24 h,收集各处理组细胞培养上清液,用硝酸还原酶法检测炎性介质no的浓度。操作步骤按试剂盒说明书完成。
1.4 细胞因子浓度测定
细胞加入刺激物后继续培养24 h,收集各处理组细胞培养上清液,用tnfα和il6 elisa试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。操作步骤按试剂盒说明书完成。
1.5 统计分析
所有数据以±s表示,采用spss 11.0统计软件对实验结果进行student’s t检验,p<0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1 穿心莲内酯对lps诱导巨噬细胞no生成的影响
收集24 h细胞培养上清,用griess法测定细胞上清中no 的含量。结果见表1。结果显示,50 μmol/l穿心莲内酯单独作用并不影响巨噬细胞no的表达(与正常对照组比较,p>0.05);1 μg/ml lps刺激可以显著诱导巨噬细胞raw 264.7产生no,而穿心莲内酯预干预能明显抑制lps引起的no的释放,并在1~50 μmol/l浓度范围内呈剂量依赖性。表1 穿心莲内酯对no分泌的影响
2.2 穿心莲内酯对lps诱导巨噬细胞tnfα、il6生成的影响
结果见表2。elisa检测结果显示,在正常情况下巨噬细胞raw264.7培养上清中tnfα、il6含量极低,50 μmol/l浓度的穿心莲内酯单独作用对其表达也无明显影响(与正常对照组比较,p>0.05)。当用1 μg/ml lps刺激后,巨噬细胞tnfα和il6的表达均明显增高,与正常对照组比较,p<0.01。用穿心莲内酯预处理能够抑制lps诱导的炎症反应,穿心莲内酯各处理组tnfα、il6浓度均明显低于lps组,两者比较差异有显著性。
3 讨论
近年来,炎症在多种疾病中,尤其是心血管疾病和肿瘤中的作用引起了广泛的关注。根据在动脉粥样硬化斑块有多种炎性细胞和炎症因子存在等证据,ross明确提出了动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)的“炎症学说”,指出慢性炎症反应是as的主要发病机制[4]。随后的研究证实,进入血管壁的巨噬细胞可被氧化型低密度脂蛋白、革兰阴性菌及其lps活化,通过nfκb、inos和cox等途径产生tnfα、il6、no、pgs等多种炎症介质,促进as斑块的形成和 发展 ,而抑制炎症反应可改善as病变程度,进一步说明了炎症在as中的关键性作用[5]。炎症与肿瘤的关系很早就引起了人们的关注。 现代 研究认为,炎症细胞主要通过分泌il1、il6、tnfα、no、pgs及活性氧等炎症因子,参与组成肿瘤微环境,影响肿瘤的进程。这些炎症因子不仅能诱导正常细胞的恶性病变,还可以促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,诱导肿瘤血管形成,在肿瘤发生发展中有重要作用[6]。2009年,mantovani在nature杂志上提出,与无限制性生长、转移等特征一样,炎症性微环境与肿瘤关系密切,并认为炎症是肿瘤的7大重要标志之一[2]。 表2 穿心莲内酯对tnfα和il6表达的影响
与正常对照组比较:**p<0.01;与lps组比较:#p<0.05,##p<0.01 目前,国内外研究者都在积极寻找抗炎药物,对心血管疾病和肿瘤进行防治研究工作[1,7-8]。我国传统中药,尤其是清热解毒中药很多具有抗炎作用,发挥中药资源在抗炎症方面的优势,寻找有效的抗炎中药,防治危害人类健康的重大疾病是中药现代化开发的需要。穿心莲内酯是清热解毒代表中药穿心莲的主要药效成分。以往研究证实,穿心莲内酯有显著的抗炎活性,能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加,还对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型有明显的抗炎作用[3],但对其细胞及分子机制并不清楚。本研究以穿心莲内酯为研究对象,初步观察了其对炎症因子no、tnfα和il6表达的影响。实验结果显示,lps刺激可以诱导巨噬细胞大量表达炎症因子no、tnfα和il6,而穿心莲内酯预处理则可以减轻lps引起的炎症反应,减少巨噬细胞炎症因子的表达。有研究显示穿心莲内酯可以阻碍nfκb与dna的结合,抑制nfκb下游基因的转录[9]。inos、tnfα、il6等基因的表达都受到nfκb的调控,因此推测穿心莲内酯抑制炎症因子表达可能与降低nfκb信号分子活性有关。本研究结果显示,穿心莲内酯能降低lps诱导的巨噬细胞炎症因子no、tnfα和il6生成,抑制炎症反应,为穿心莲内酯应用于动脉粥样硬化、肿瘤等炎症相关性疾病的 治疗 提供了理论基础。
【 参考 文献 】
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