作者：谢富华，吴小云，王润秀，熊亮，梁念慈
【摘要】 目的： 构建存活素（survivin）基因短发夹rna(shrna)的表达质粒，为乳腺癌rnai介导的基因 治疗 打下基础. 方法 ： 设计并合成有小发夹结构的8条survivin shrna对应模板序列，退火并与pshuttle 1.0cmv载体重组质粒；将重组质粒转染人乳腺癌细胞mcf7；mtt实验筛选出最有效质粒及其有效浓度，流式细胞术检测细胞周期的变化，经hoechst染色观察凋亡情况，rtpcr和western blot检测survivin基因的表达情况. 结果： 成功构建重组质粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度；细胞受阻于g2/m期，并通过荧光染色发现有凋亡细胞；survivin基因表达受到抑制. 结论： 构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达，这为 研究 乳腺癌rnai介导的基因治疗打下基础.
【关键词】 survivin； rna干扰； shrna
0引言
存活素（survivin）基因几乎表达于所有常见的人类肿瘤组织，尤见于乳腺癌和肺癌［1］. 有研究证明将小于30个核苷酸的小干扰rna（small interferencing rna, sirna）或短发夹rna(shrna)表达载体转入哺乳动物细胞中，同样能产生沉默效应. 目前 ，其载体构建大多是用rna聚合酶ⅲ依赖的启动子u6或h1进行表达的［2-3］，但是用rna polⅱ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效［4］. 本实验我们设计针对survivin基因的shrna表达质粒，将其转染人乳腺癌mcf7细胞，初步探讨其诱导mcf7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的 影响 .
1材料和方法
1.1材料pshuttle 1.0cmv载体（产地ambion公司）；lipofectamine 2000转染试剂盒(invitrogen)；各种限制性内切酶和t4 dna连接酶（大连宝生物公司）；总rna提取试剂盒(加拿大biobasic公司)；逆转录聚合酶链反应( rtpcr)试剂盒（美国qiagen公司）.
1.2方法
1.2.1shrna的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列： ① 5′ggaccaccgc atctctacattcaagaac3′, ②5′acagagaaag agccaagaacaaa3′, ③5′aatttga ggaaactgcggaga3′和一个错义序列5′tatgagaatggcagcga gata3′（其碱基组成同序列③，但排列顺序不同），同源 分析 未见相同序列.
1.2.2重组质粒的构建和鉴定shrna转录模板dna链的设计： 按pshuttle 1.0cmv载体要求以反向重复方式设计发夹结构：正义链：5′ctagt反向序列tctcttgaa正向序列c3′，反义链：5′tcgag正向序列ttcaagaga反向序列a3′. 重组质粒的构建：模板链合成并退火，将其定向克隆至穿梭载体pshuttle 1.0cmv中；转化dh5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单克隆，分别命名为pshuttlesurvivin(13)和pshuttlecontrol. 重组质粒的鉴定：提取质粒分别用xhoⅰ和ecorⅰ酶切，取初步鉴定的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序.
1.2.3细胞培养与转染乳腺癌细胞株mcf7用含100 ml/l胎牛血清的rpmi1640培养液培养于37℃含50 ml/l co2的培养箱中. 转染前24 h将约1×105个细胞接种至6孔板，转染时细胞融合度达30%～50%. 按lipofectamine 2000操作手册进行转染：用质粒pshuttlesurvivin(13)以50 nmol/l的浓度分别转染细胞，设立阴性（加pshuttlecontrol）和空白对照组（加lipofectamine 2000），每组设3个平行孔，培养24 h后行mtt检测，筛选出最有效的shrna表达质粒，将最有效的质粒分别以5，10，50，100，150 nmol/l的终浓度转染mcf7细胞，每组设3个平行孔，设立对照组，培养24 h后再次行mtt检测［5］.
1.2.4流式细胞术检测接种mcf7细胞于60 mm平皿中（2×106/皿）. 接种后24 h，以最有效质粒的最佳浓度转染细胞，设阴性和空白对照组. 转染后48 h收集细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，pbs清洗1次，离心去pbs，加入预冷的700 ml/l的乙醇，4℃固定16 h以上. 离心去乙醇，pbs清洗1次，加0.5 ml 50 mg/l pi（含100 mg/l rnase a）于避光处染色30 min，用coulter eptcsxl31240流式细胞仪进行检测.
1.2.5hoechst荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750 ml/l乙醇中浸泡24 h以上，风干，将盖玻片置于六孔板内，种入mcf7细胞培养过夜. 加入含最有效质粒的最佳浓度的培养基，作用24 h，设阴性和空白对照组. 吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，4℃固定过夜. 去固定液，用pbs洗两遍，每次3 min，吸尽液体. 加入0.5 ml hoechst 33258染色液，摇床上染色5 min. 用pbs洗两遍，每次3 min. 加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜检测.
1.2.6rtpcr检测按一步法rtpcr试剂盒说明书提取rna后行pcr. survivin基因引物（产物为166 bp）p1：5′cagatttgaatcgcgggaccc3′，p2：5′ccaagtctggctcgt tctcag3′；gapdh 引物（产物为280 bp）p1：5′gtagaggcag ggatgatgttc3′，p2：5′gagttag ctcactcattaggc3′. 反应条件：50℃反转录30 min；95℃初始pcr激活反应15 min；94℃变性0.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min；共35个循环；72℃反应延伸10 min. 取pcr产物3 μl于10 g/l琼脂糖凝胶电泳.
1.2.7western blot检测细胞转染后48 h提取总蛋白，经bradford法测定蛋白浓度，设立空白和阴性对照. 每组分别取20 μg用以检测内参βactin蛋白质，取60 μg以检测survivin蛋白，蛋白经100 g/l sdspage电泳，100 v电转1 h，100 g/l脱脂奶封闭过夜. 在装有抗survivin抗体和pvdf膜的袋中室温下摇动2 h，洗膜后加入二抗，室温下摇动1 h. 增强化学发光显色曝光.
统计学处理：采用sas8.0软件包进行统计学分析，p<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1重组质粒酶切鉴定及测序结果该试剂盒提供的穿梭载体中不存在ecorⅰ位点，但存在xhoⅰ位点，故用这两种酶分别消化后其分子大小虽相同，但由于分子形状不同而电泳速度不同（图1）. 测序结果证实构建成功.
1,2; 3,4; 5,6: 重组质粒pshuttlesurvivin(13); 7,8: pshuttlecontrol; 1,3,5,7: xhoⅰ酶切； 2,4,6,8: ecorⅰ酶切.
图1重组质粒的ecorⅰ或xhoⅰ酶切结果（略）
2.2mtt法筛选结果转染pshuttlesurvivin(13)，lipofectamine 2000和pshuttlecontrol各组干扰效率与空白对照组相比较，分别为：65.53%，76.12%，86.68%，4.40%和7.70%. 对mtt检测结果进行完全随机设计的方差 分析 ： lipofectamin 2000组，pshuttlecontrol组与空白对照组间的差异无统计学意义(p>0.05),表明lipofectamine 2000和错义序列不会 影响 mcf7细胞的生长；而pshuttlesurvivin(13)组与空白对照组间的差异均有统计学意义(p<0.05)，以pshuttlesurvivin3的干扰效果最佳. 在转染了不同浓度pshuttlesurvivin3后24 h，5，10，50，100，150 nmol/l组干扰效率分别为80.41%，93.35%，84.52%，72.07%和68.33%，经q检验法分析，各组两两间的差异均有统计学意义(p<0.05).
2.3流式细胞术结果流式细胞术检测显示转染组中g2/m期细胞的比率升高. 错义序列组和脂质体对照组中，mcf7细胞的细胞周期未出现上述变化(图2)，表明shrna表达载体的转染对mcf7细胞的增殖具有抑制作用，与mtt比色法检测的结果相符.
a: shuttlecontrol组； b: lipofectamine 2000组； c: pshuttlesurvivin3组.
图2流式细胞术结果（略）
2.4hoechst荧光染色结果hoechst33258染色检测显示实验组的细胞核出现凋亡的形态学改变(图3)，表现为细胞核染色质高度聚集并裂解为碎块，可见凋亡小体；脂质体对照组及错义序列对照组的细胞，均没有出现上述形态学改变.
a: pshuttlecontrol组； b: lipofectamine 2000组； c: pshuttlesurvivin3组.
图3转染shrna后mcf7细胞的形态学改变hoechst染色 ×400（略）
2.5rtpcr检测结果琼脂糖凝胶电泳显示，脂质体空白对照组及错义序列组的样本于约166 bp处均可见清晰的条带，实验组的条带明显减弱，而各组相应的内参照gapdh的条带一致(图4).
2.6western blot检测pbs及pshuttlecontrol组均可见清晰的条带，而pshuttlesurvivin组的条带明显减弱；各组相应的内参照的条带一致(图5).
3讨论
在细胞增殖周期中，survivin基因主要表达于g2/m期，起调节基因作用，可对抗g2/m期凋亡的诱导，在癌症中的过度表达克服凋亡的关卡（checkpoint），抑制胞凋亡效应性蛋白酶caspase3，通过有丝分裂促进转化细胞的异常增殖（aberrant progression）［6］；同时引起细胞cmyc和cyclind1的表达水平增高，激活端粒酶，从而延长细胞的寿命，导致细胞癌变，在肿瘤的发生 发展 中起重要作用.
1: pshuttlecontrol组; 2: pshuttlesurvivin3组; 3: lipofectamine 2000组； m： marker.
图4rtpcr结果（略）
1: pbs空白对照组； 2: pshuttlesurvivin3组； 3: pshuttlecontrol组.
图5western blot检测结果（略）
自从rnai现象发现至今， 研究 人员一直试图解释它的机制. 有研究报道在拟南芥转录后沉默中有与沉默基因两条链都互补的（21～23）个核苷酸的小rna分子［7］. 随后这些小分子rna进行了测序分析，发现它们是3′末端带有2个核苷酸突出的（21～23）个核苷酸的dsrna分子. 后来将这些rna分子命名为短干扰性rna. 大于30个核苷酸的dsrna被导入哺乳动物细胞中，会激活抗病毒反应引起非特异性干扰素效应［8］，所以在这类细胞中需要另寻途径获得稳定的基于dsrna的沉默效应［9］，很多靶序列不具备这些特点同样有效，甚至有些基因靠近3′的靶点反而更有效［10］.
本实验基于上述shrna设计的一般原则，结合载体系统要求再线设计了3种shrna并克隆到穿梭载体中，为了达到 经济 而有效的干扰效果并减少对细胞的毒性，在转染mcf7细胞后，通过mtt实验筛选出最有效质粒及其有效浓度. 流式细胞术检测虽未有凋亡峰出现，但处于g2/m期的细胞明显增多，并进一步通过hoechst染色观察到典型的凋亡现象；rtpcr和western blot发现survivin基因的表达明显受到抑制. 该表达载体的构建与筛选，为下一步用腺病毒包装，感染荷瘤裸鼠行靶向rnai抗乳腺癌的体内研究打下坚实的基础.
【 参考 文献 】
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