核转录因子κb在大鼠小肠缺血再灌注后tnfα诱导的肺损伤中的作用
【关键词】 缺血再灌注;肿瘤坏死因子α;核因子κb
【摘要】 目的 观察核转录因子κb(nfκb)在大鼠小肠缺血再灌注(i/r)后肿瘤坏死因子α(tnfα)诱导的肺损伤中的作用。方法 48只雄性wistar大鼠，随机分为正常组、假手术组、对照组和实验组，建立小肠i/r模型，于i/r后24 h取材，采用组织病理学、免疫组织化学染色技术和图像分析技术，观察肺组织病理学改变和nfκb的表达。结果 nfκb的阳性表达位于肺泡上皮细胞胞核或者胞浆，其表达强度实验组高于对照组、假手术组和正常组(p<0.05)。结论 nfκb参与到大鼠小肠i/r损伤后tnfα诱导的肺上皮细胞凋亡中的病理变化过程中。
【关键词】 缺血再灌注;肿瘤坏死因子α;核因子κb
随着人口老龄化的发展，肠系膜血管缺血性疾病发生率逐年增多，这种疾病是由于肠系膜血管急性血循环障碍，导致肠管缺血坏死。小肠缺血不仅引起小肠的损害而且同时可以诱发全身炎性反应，例如，肺脏、肝脏、肾脏等远隔脏器的损害，引起急性呼吸窘迫综合征(ards)和多器官功能障碍综合征(mods)是患者死亡的主要原因之一〔1〕。细胞炎性介质释放的增加和细胞凋亡的产生以及脏器损害的发生机制，至今为止还不清楚。WWw.11665.CoM本文拟通过探讨肿瘤坏死因子α(tnfα)诱导细胞凋亡的同时以及核转录因子κb(nfκb)表达的研究，对小肠缺血所引起的远隔脏器损害的发生机制进行分析，探寻一种全新的预防和治疗肠系膜血管缺血性疾病导致ards和mods的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
nfκb(1∶100)、tnfα购自武汉博士德生物工程有限公司。ultra sensitivetm sp超敏试剂盒(鼠/兔)和dab显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.2 方法
健康雄性wistar大鼠48只，清洁级，2～3月龄，体重200～250 g，吉林大学实验动物中心提供。随机分为正常组、假手术组、对照组和实验组。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g体重)，麻醉满意后，取仰卧位固定。腹部常规消毒后无菌条件下取腹正中切口约3～4 cm入腹，将肠管推向左侧，游离肠系膜上动脉，以无创伤动脉夹夹闭肠系膜上动脉起始部，缝合切口〔2〕。60 min后经原切口进腹，取出动脉夹，恢复血供。再灌注结束后，实验组动物给予腹腔注射tnfα(1.5 mg/100 g体重)，对照组不给予腹腔注射tnfα，假手术组不予阻断肠系膜上动脉。24 h后，所有大鼠脱颈处死，剪开胸腔，充分暴露肺脏，左肺进行灌注固定，右肺立即取部分肺组织称湿重(w)并记录，而后置于80℃烘箱烘干48 h至恒重，称干重(d)，求得湿干比值(w/d)。左肺置于10%甲醛中4 ℃下固定24 h后，酒精梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，切片，厚度2 μm。采用链霉素菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接法(sp)免疫组织化学染色，按试剂盒操作说明进行，dab显色，苏木素复染。在低倍镜(40倍)下选取阳性表达密集区，在高倍镜(400倍)下观察细胞形态、染色定位和程度。每组选取6张切片，每张切片随机选取5个不同重叠视野，输入计算机分析累积光密度值。
1.3 统计学分析
数据均以x±s表示，采用spss13.0统计软件进行最小显著差(lsd)检验。
2 结 果
2.1 肺组织病理学改变
正常组和假手术组大鼠肺组织无明显变化，肺泡腔为含气空腔，壁薄，无明显充血、水肿、炎性细胞浸润。对照组肺组织仅有肺泡壁增厚，肺间质增宽改变，而实验组可见肺泡结构破坏，肺泡隔增宽且肺泡间隔有大量中性白细胞浸润，肺泡腔内有渗出液、红细胞及渗出中性白细胞。图1 各组大鼠肺组织中nfκb免疫组织化学染色(×400)
2.2 肺组织w/d值的变化
实验组肺组织的w/d值(6.58±0.05)显著高于正常组(3.18±0.03)、假手术组(3.21±0.02)和对照组(4.25±0.04)(均p<0.05);对照组肺组织w/d较假手术组和正常组明显升高(p<0.05)。
2.3 肺组织nfκb的检测
与对照组比较，实验组nfκb表达增强，主要分布在肺泡上皮细胞的胞核或者胞浆，棕黄色，颗粒状，见图1。实验组nfκb累积光密度值(2 387.83±121.73)较对照组(1 317.07±96.31)有显著差异(p<0.05);对照组肺组织nfκb累积光密度值较假手术组(413.08±46.37)和正常组(506.71±60.59)明显升高(均p<0.05)。
3 讨 论
小肠i/r后远隔脏器的肺脏、肝脏、肾脏内的嗜酸性淋巴球和细胞活性因子等增高，其中增加的tnfα是导致肺脏损害的主要因子之一，并且可以诱导肺上皮细胞的凋亡。本实验结果表明tnf对肺脏损伤具有重要作用，同时小肠i/r后肺损伤模型建立成功。
肺组织w/d是目前常用的评价肺水肿和反映微血管损伤的指标，肺组织损伤后，微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞间隙增大,导致肺泡腔内大量炎性物质渗出、集聚、出血及炎性细胞游走。因此，肺损伤后w/d升高，而实验组w/d值显著高于正常组、假手术组和对照组，证明实验组大鼠肺损伤较重。
nfκb是包括7个结构相似的转录因子(p50,p105，p52，p100，rela/p65，crel and relb)的一个家族，在炎症及压力的反应中通过控制基因网络表达具有中心作用〔3〕。nfκb家族中的成员被认为是能够激活许多前期炎症因子的表达，包括肺部的炎症〔4〕。肺组织是血液氧气交换的器官，因此位于氧气交换的环境中〔4〕，而活性氧和自由基容易产生氧化还原敏感的转录因子，即nfκb。活化的nfκb可以调节炎症介质的表达〔5〕。除了活性氧，细胞氧化状态，尤其是硫氢化合物能够直接激活nfκb，信号传导和基因表达，导致细胞外病理生理改变〔5〕。以前的关于抗氧化剂研究表明，nfκb的激活是氧化敏感的，通过调节氧化/抗氧化的平衡可以调节其改变，进一步研究表明，tnfα激活nfκb，能够刺激产生氧化物〔6，7〕。
nfκb的活化在急性肺损伤的发生发展中起重要作用〔8，9〕。本研究表明，实验组大鼠肺组织高表达nfκb。说明nfκb激活，参与到小肠i/r后tnfα诱导的肺损伤中，是tnfα细胞信号通路中的重要一部分组成。抑制其表达活性，可能减轻肠系膜血管缺血性疾病导致的ards和mods。
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