【摘要】 目的：分析胃癌患者th1和th2两类细胞因子的基因表达与转录因子tbet和gata3表达的相关性,从细胞因子与转录因子角度考证胃癌患者th1/th2细胞分化趋势，探讨p53与tbet的相关性，了解tbet与肿瘤转移之间的关系。方法：利用荧光定量pcr技术检测55例胃癌患者及45例正常人外周血单个核细胞（pbmc）中tbet、gata3转录因子和ifnγ、il4等细胞因子的水平，应用免疫组化法检测胃癌组织中p53的表达状况。结果：55例胃癌患者tbet、gata3、ifnγ、il4的表达率依次为51%（28/55）、78%（43/55）、27%（15/55）、69%（38/55）。定量pcr结果显示，病人组的tbet和ifnγ明显低于正常对照组（p<0.01），而gata3和il4则明显高于正常对照组（p<0.01）。tbet与ifnγ在病人体内的mrna表达存在正相关性（p<0.01），正常人则没有。gata3与il4的表达在两组中均呈明显正相关（p<0.01和p<0.05），且在p53阳性的患者中，tbet的表达率较低,而gata3的表达率较高。结论：胃癌患者有明显th2漂移现象，且p53的表达与tbet的表达呈负相关。
【关键词】 胃癌 th1/th2 细胞因子 转录因子 基因表达
study on the relationship between expression of tbet/gata3 and metastasis of gastric carcinoma
qiu gufeng,wang suoying,wang shengjun,ma jie,mao chaoming,zhu pei,yang min,xu xiaopeng,chen jianguo,hu zhengjun,shao qixiang,huang xinxiang,xu huaxi.
department of immunology, school of medical technology, jiangsu university，zhenjiang 212003,china
［abstract］ objective:to confirm differentiation of th1/th2 on the levels of transcription and cytokines production in patients with gastric carcinoma,and to reveal the relationship between the expression of tbet/gata3 and th1/th2 type cytokines in peripheral blood mononuclear cells(pbmc).in addition, the relation of p53 and tbet expression was discussed for understanding the role of tbet in metastasis. methods:the gene expression of th1/th2 type cytokines ifnγ/il4,transcription factors tbet/gata3 were determined by rtpcr and realtime rtpcr from 55 patients with gastric cancer and 45 normal person. the expression of p53 was analyzed by immunohistochemistry. results: predominant expression of th2 type cytokines was detected in 55 gastric cancer patients. the expression rates of tbet,gata3,ifnγ and il4 was 51%（28/55）,78%（43/55）,27%（15/55）and 69%（38/55）,respectively. the expression rates of tbet and ifnγ in patients were lower than control groups, but the results of gata3 and il4 were opposite. the similar results were obtained by realtime pcr. there was a positive correlation between the expression of tbet and ifnγ in patient, but no relationship in normal person. the positive correlation between gata3 and il4 was also found in patients and in normal person. the expression of p53 in patients was accompanied with lower expression rate of tbet and higher expression of gata3.conclusions:predominant expression of th2 type cytokines may be related to lower expression of tbet or higher expression of gata3 in pbmc of gastric cancer patients. the negative correlation exists between p53 and tbet.
［key words］gastric carcinoma; th1/th2; cytokines; transcription factors; gene expression
在我国胃癌一直是死亡率最高的恶性肿瘤，且胃癌患者死亡的主要原因是术后转移。wwW.11665.cOM目前认为，自身免疫性疾病表现为典型的thl漂移，肿瘤和超敏反应性疾病则呈现th2漂移,但在胃癌病人体内该现象还未被证实[1，2]。我们通过对部分胃癌患者外周血单个核细胞（pbmc）中tbet、ifnγ、il4以及gata3的mrna的表达水平来验证这一推论，同时通过检测癌组织p53的表达，探讨tbet表达与癌转移之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 主要制剂
ficoll泛影葡胺购于中国医学科学院生物工程医学研究所，鼠抗p53试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供,trizoi、rtpcr试剂均购自invitrogen公司，ta克隆试剂盒、凝胶回收试剂盒（wizard sv gel and pcr cleanup system）和 pgemt vector systems i均为promega公司产品，质粒小量提取试剂盒（ nucleospin plasmid extract kit ）为德国machereynagel公司，限制性内切酶pvuii（takara公司）。
1.2 标本收集
选取江苏大学附属医院和附属人民医院普通外科2005年12月至2006年4 月间55例胃癌病人新鲜edta抗凝全血4ml以及手术切除癌组织，其中男35例，女20例，年龄32～75（平均58.6±11.3）岁，所有病例均有完整的临床病理资料，术前均未行放疗或化疗。其中，乳头状腺癌6例，管状腺癌22例，低分化腺癌9例，粘液腺癌5例，印戒细胞癌8例，未分化癌4例；伴淋巴结转移者32例，其中广泛转移10例，无淋巴结转移者23 例。依胃癌组织分化程度将其归为两大类：乳头状腺癌、管状腺癌为分化较好组；低分化腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌为分化较差组。胃癌病理诊断参照1980年全国胃癌协作会议制定的标准，病理组织学分型及ptnm分期分别根据世界卫生组织（who）和1988年国际抗癌联盟（uicc）颁布的方案实施。正常对照组为45例健康体检者，年龄30～65（平均46.3±10.8）岁。
1.3 外周血单个核细胞的分离及总rna的提取
用pbs以1:1的比例稀释抗凝血，置等体积ficoll泛影葡胺上，2 000 r/min常温离心20分钟。吸取低密度细胞层，以pbs洗2遍备用。
1.4 tbet、ifnγ、gata3及il4mrna表达水平的检测
作realtime rtpcr，以gapdh为内参照。所有引物皆由上海生工合成，各引物序列及扩增长度见表1。表1 引物序列及扩增长度（略）
1.4.1 总rna提取和逆转录
分别在病人和正常人外周血单个核细胞中加入trizol试剂，提取总rna，并严格按逆转录试剂盒说明书合成cdna，每20 μl逆转录体系中含4 μg总rna、1 μl oligodt、2 μl 10×buffer、2 μl mgcl2(25 mmol/l)、2 μl dtt(0.1 mol/l)、1 μl dntps(10 mmol/l)及1 u superscript reverse transcriptaseⅱ。
1.4.2 rtpcr反应体系为
5×pcr buffer 5 μl、0.5 μl cdna模板、2.5 μl dntps (2.5 mmol/l)、2.0 μl mgcl2(25 mmol/l),上下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)， 40 u taq 聚合酶0.2 μl,用ddh2o补足至25 μl。
1.4.3 ta克隆
使用ta克隆试剂盒，将纯化后的pcr产物连接入pgemt载体，转化入dh5α感受态菌，筛选阳性克隆，经扩菌后，提取质粒，用puvii限制性内切酶酶切鉴定。
1.4.4 定量pcr标准曲线绘制
用eppendof biophotometer 测定质粒浓度，按公式：c×10-92(r+3000)×324.5×6.02×1023(copies/μl)计算质粒数，稀释成109～104梯度浓度，做定量pcr，测定并绘制标准曲线。
1.4.5 realtime pcr反应体系
5×定量pcr缓冲液5 μl、0.5 μl cdna模板、2.5 μl dntp(2.5 mmol/l)、mgcl2(25 mmol/l)2.0 μl,引物各0.5 μl(10 pmol/μl)及40 u 定量taq 聚合酶,sybergreeni(1:2 000稀释)1 μl,用ddh2o补足至25 μl。
1.5 免疫组织化学sp法
按鼠抗p53试剂盒试说明书进行操作。dab显色, 苏木精复染, 用已知的阳性组织切片作为阳性对照,以pbs代替一抗作为阴性对照。
结果判断标准: p53 的表达以细胞核呈清晰的棕色或胞核、胞浆同时呈棕色为阳性。光镜下随机选取5个高倍视野,共计数500个细胞，算出阳性细胞的百分数, 将阳性染色的癌细胞数≤25%定为阴性表达, >25%为阳性表达, 即过表达。
1.6 统计学处理
采用t检验进行两组间比较和相关分析，采用spearman秩合检验分析tbet与p53的相关性，以p＜0.05为有显著性差异。所有数据均由stata7.0软件处理。
2 结 果
2.1 正常人与胃癌患者tbet、gata3、ifnγ和il4mrna表达率的比较
正常人tbet、ifnγ、gata3及il4的mrna表达率依次为56%（25/45）、49%（22/45）、51%（23/45）及40%（18/45）；胃癌患者pbmc的tbet、gata3、ifnγ和il4mrna表达率依次为47%（28/55）、72%（43/55）、25%（15/55）、63%（38/55）。
2.2 胃癌组与正常对照组tbet、gata3、ifnγ和il4mrna表达量的比较
如图1所示，病人组tbet及ifnγ显著低于正常对照组（p＜0.01），而gata3及il4则明显高于对照组（p＜0.01）。
2.3 tbet/ifnγ和gata3/il4相关性比较
由图2可见，在患者tbet与ifnγ的mrna表达具有明显相关性（p＜0.01），而在正常人两者的相关性则不明显。胃癌患者及正常人体内gata3与il4的表达皆呈现明显相关性（p＜0.01），见图3。此外，tbet与ifnγ/il4比值亦具相关性（p<0.05），而gata3与该比值无明显相关性，见图4。
2.4 同一患者癌组织p53表达与tbet、gata3表达的相关分析
如图5、6所示，图5为p53表达阴性的胃癌组织，图6为p53表达阳性的癌组织。由表2可见，p53的总表达率为47%，p53阳性而tbet阴性的患者有22例（40%），10例广泛转移患者均在其中；p53阴性而tbet阳性者24例（44%），在p53阳性表达者中仅3例为tbet阴性。利用spearman秩和检验算得tbet与p53的spearman's rho 为-0.672 8，p<0.01,两者呈负相关；gata3与p53的spearman′s rho为0.736 6，p<0.01,两者呈正相关。表2 胃癌患者癌组织中p53与tbet、gata3mrna表达的比较（略）
3 讨 论
胃癌的发病因素和确切机制至今仍不很清楚,目前普遍认为是内外因素综合作用的结果,其中机体免疫状态的改变对胃癌的发生及病情进展的影响受到了关注。免疫功能是人体十分重要的生理功能，在正常生理状态下，th1细胞分泌的特征性细胞因子主要有il2、ifnγ;th2细胞主要分泌il4、il10。前者主要参与促进细胞免疫应答,后者主要在体液免疫应答中发挥正向调节作用。这两类细胞交叉调节、相互抑制,对维持免疫平衡起重要作用。th1和th2细胞的共同前体为th0细胞，th0细胞受到抗原激发后按一定比例分别向thl和th2细胞分化，两者处于相对平衡状态，其中转录因子tbet正向调控th1细胞的分化发育,gata3则正向调控th2细胞，两者共同作用的结果最终决定着th0细胞的分化方向[35]。当机体免疫功能异常时，th0细胞分化的thl和th2亚群比例及功能失衡，出现相应的thl或th2漂移性疾病，这种th2型漂移现象与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关[6]。
以往习惯以细胞因子的表达来分析th1/th2的平衡，但新近研究发现转录因子更能提供可靠的信息，tbet就是其中之一[7]。tbet表达于t、b、nk细胞、巨噬细胞和树突状细胞,它作为专一性的ifnγ基因的反式激活剂,能特异性地促进th0细胞向th1细胞分化并抑制th0细胞向th2细胞分化[4,8]。而gata3的作用与tbet相反，它能促进th0细胞向th2细胞分化，同时抑制th0细胞向th1细胞分化[9]。本研究从th细胞特异性转录因子及其相关细胞因子的角度,论证了发生在胃癌患者的这一漂移现象。从我们的数据可以分析得出，胃癌患者体内呈典型的th2漂移现象，且病人体内tbet与ifnγ、gata3与il4呈高度相关性,而在正常人体内只有gata3与il4有相关性。结果显示的tbet与ifnγ/il4比值的相关性,比gata3与该比值的相关性明显，说明在外周血中tbet在调节th1/th2平衡中扮演更重要的角色。业已表明，机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，th1细胞是参与细胞免疫的重要正向调节细胞，其产生和分泌的ifnγ不仅调节着效应性t细胞的功能，而且具有直接效应或激发和促进nk细胞等的杀瘤作用。th1/th2细胞平衡向th2细胞偏移，势必削弱机体的抗瘤免疫功能，有助于肿瘤细胞的免疫逃逸和组织转移。tbet和gata3分别是th1和th2细胞的转录因子，控制着th1/th2细胞的分化方向，在我们的研究结果中，胃癌患者tbet的表达水平降低，进一步从源头上表明此类癌症细胞免疫功能低下的关键因素。然而，胃癌患者tbet表达水平降低以及因此导致的th2细胞分化、ifnγ分泌的减少等现象，究系胃癌发生之因或癌症产生的后果，尚需深入研究追溯。有趣的是，本研究结果显示的gata3在胃癌患者表达水平的增高，这仅仅是tbet表达降低或th2细胞分化的影像，还是另辟途径参与了胃癌的发生发展，亦待进一步试验考证。
转移是胃癌患者主要的死亡原因之一, 也是治疗中面临的难题，它是一个复杂过程,表现为多阶段性、多基因参与、多种转录因子调控。近年来研究发现, 一些转录因子在转移相关基因的表达调控中起重要、甚至是关键性的作用。有国外学者报道，tbet 敲除的小鼠体内癌细胞扩散的速度远超过正常小鼠[10]。在人体内，我们选取p53这一与转移密切相关的基因作为转移的观察指标。p53 基因是一种抑癌基因, 免疫组化所检测的主要为突变型p53,突变型p53可能使细胞出现失控生长,对细胞凋亡呈抑制作用，使肿瘤细胞的侵袭力增加,容易发生转移[11,12]。本研究发现, 胃癌组织中p53阳性率在低、中分化病例中明显高于高、中分化病例, 有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移的病例，说明分化程度差、有淋巴结转移者，p53 的阳性表达率高。在对p53与tbet的表达频率分析之后发现，p53与tbet在胃癌患者的表达频率有相关性，说明在胃癌患者体内tbet表达频率的高低与肿瘤的转移相关。
本文的实验结果和分析结论表明，胃癌的发生和转移是免疫调节失控的结果，然而一旦发生癌症，则有可能进一步加重这种免疫调节的失控，形成恶性循环，及时调整这种状态有助于疾病的控制。tbet基因的表达与胃癌的发生和转移密切相关，tbet基因的表达水平可以作为临床评价胃癌转移及预后的一个很好的指标。
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