目的 观察糖耐康药物血清干预转化生长因子-β1（tgf-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（hk-2）纤维化细胞因子的作用，探讨糖耐康防治肾纤维化的作用机理。方法 将hk-2 细胞用含10 %胎牛血清的dmem/f12（1∶1）培养基培养。实验分为空白对照组、单纯tgf-β1诱导组（tgf-β110 ng/ml）、空白血清对照组（tgf-β110 ng/ml+10%空白血清）、干预1组（tgf-β110 ng/ml+5%糖耐康药物血清）、干预2组（tgf-β110 ng/ml+10%糖耐康药物血清）、干预3组（tgf-β110 ng/ml+20%糖耐康药物血清）。药物干预24 h后，荧光定量pcr检测结缔组织生长因子（ctgf）、纤溶酶原激活物抑制物-1（pai-1）、基质金属蛋白酶-9（mmp-9）mrna的表达。结果 hk-2细胞经tgf-β1诱导后，ctgf、pai-1 mrna的表达显著上升，而mmp-9 mrna的表达减弱，与空白对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）。经糖耐康药物血清干预后，ctgf、pai-1 mrna的表达逐步下降，而mmp-9 mrna的表达逐步上升，与单纯tgf-β1诱导组比较差异有统计学意义（p<0.05）。结论 糖耐康在一定程度上能够抑制tgf-β1诱导人肾小管上皮细胞纤维化，其机制可能与调节纤维化细胞因子表达有关。
　　关键词：糖耐康；转化生长因子-β1；人肾小管上皮细胞；结缔组织生长因子；纤溶酶原激活物抑制物-1；基质金属蛋白酶-9
　　doi：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.06.011
　　中图分类号：r285.5 文献标识码：a 文章编号：1005-5304（2013）06-0029-03
　　糖尿病肾病（dn）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，严重威胁着糖尿病患者的生活质量和生命健康。wWW.11665.coMdn的发病机制目前尚未明确。既往认为dn的早期病变部位在肾小球，
　　基金项目：国家自然科学基金面上项目（30973909）；北京中医药大学创新团队项目（2011-cxtd-19）
　　通讯作者：刘铜华，e-mail：[email protected]
　　近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性更为密切，故肾间质纤维化的机制在dn的发展中越来越受到人们的重视[1]。调节纤维化细胞因子的正常表达在一定程度上能够抑制纤维化的发展。人肾小管上皮细胞（hk-2）的结缔组织生长因子（ctgf）、纤溶酶原激活物抑制物-1 （pai-1）、基质金属蛋白酶-9（mmp-9）等纤维化细胞因子mrna表达的影响，进一步探讨其对肾间质纤维化的作用，为其防治dn肾间质纤维化提供实验依据。
　　1 实验材料
　　1.1 细胞株
　　hk-2购自兰州大学实验中心。
　　1.2 动物
　　wistar大鼠24只，雄性，体质量（200±20）g，spf级，甘肃中医学院动物中心提供，许可证号：scxk（甘）2004-0006。
　　1.3 药物与试剂
　　dmem/f12（1∶1）细胞培养基，gibco公司；胎牛血清，hyclon公司；edta、胰蛋白酶，amresco公司。人重组tgf-β1，r&d system公司生产，根据说明书，用含1 mg/ml牛血清白蛋白的无菌弱盐酸（4 mmol/l）配制为1 ?g/ml的储存液，无菌ep管-70 ℃储存，用时配成10 ng/ml浓度[2]。人ctgf、pai-1、mmp-9 mrna引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。糖耐康颗粒，北京中医药大学提供，主要由人参、女贞子、夏枯草、三白草、番石榴叶等组成。每克粉剂相当于3.61 g原药材，临床成人用量为每日54.15 g原药材，相当于0.902 5 g原药材/kg。
　　1.4 仪器
　　co2培养箱，heal cell hl90，likang；超净生物安全柜，escd classⅱbsc，airstream；倒置显微镜，olympus x-71， olympus，japan；pcr仪，型号abi7300，abi公司；紫外可见分光光度计，uv1100 5970019，上海天美科学有限公司。
　　2 实验方法
　　2.1 糖耐康药物血清制备
　　spf级wistar雄性大鼠24只饲养于中国人民解放军兰州军区总医院屏障级动物实验室[许可证号：syxk-（军） 2007-022]，普通饲料喂养。随机分为空白组、中药组，每组12只。中药组按成人临床用量的10倍灌胃，空白组灌服同体积生理盐水。每次1 ml/100 g体质量，上下午各1次，间隔12 h，连续灌胃3 d。于末次灌胃前8 h禁食不禁水；30 min后，大鼠股动脉无菌采血；静置2 h，3000 r/min冷冻离心20 min，取上清，将同组血清混合；56 ℃水浴灭活30 min，-20 ℃低温保存备用。
　　2.2 细胞培养
　　hk-2 细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素、100 ?g/ml链霉素 dmem/f12（1∶1）完全培养基，于37 ℃、

5%co2细胞培养箱中培养。每隔2～3 d换新鲜培养基1次，培养融合至80% 以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05% edta的消化液消化，用完全培养基终止消化后，1000 r/min离心5 min。用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前先用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。
　　2.3 分组
　　传代培养的hk-2细胞分为6组。空白对照组：dmem/f12培养液；单纯tgf-β1诱导组：dmem/f12培养液+10 ng/ml tgf-β1；空白血清对照组：dmem/f12培养液+10 ng/ml tgf-β1+10%空白血清；干预1组：dmem/f12 培养液+10 ng/ml tgf-β1+5%糖耐康药物血清；干预2组：dmem/f12培养液+10 ng/ml tgf-β1+10%糖耐康药物血清；干预3组：dmem/f12 培养液+10 ng/ml tgf-β1+20%糖耐康药物血清。管上皮细胞结缔组织生长因子、纤溶酶原激活物抑制物-1及基质金属蛋白酶-9 mrna表达检测
　　细胞以6000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 ?l，每组设3个复孔，培养过夜。吸弃细胞上清，加入无血清培养基同步化24 h。再次弃细胞上清，按照分组加入相应药物的培养液200 ?l，继续培养24 h。提取rna进行pcr实验操作。
　　总rna抽提：①用枪头吸尽培养基，向各孔中加入125 ?l×2的washing buffer。②用枪头吸尽cell amptm washing buffer，后向各孔中加50 ?l processing溶液，反复吹打processing液后，移至微量离心管中。③75 ℃水浴5 min，分装得到的细胞裂解液。将提取出的总rna进行完整性分析及纯度测定。
　　反转录反应：根据rt反应体系（见表1），于pcr管中相应体积的5×primescripttm buffer，primescripttm rt enzyme mix ⅰ，oligo dt primer（50 ?mol/l）×1，random 6 mers，rnase free dh2o分装，再加入rna样品，迷你离心机混匀，进行pcr反转录反应：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，反转录所得产物为模板cdna，-20 ℃保存以备后续扩增用。此过程均在冰上操作。
　　pcr扩增反应：根据pcr反应体系组份（见表2），于pcr管中加入相应体积的sybr premix ex tapⅱ（2×），pcr forward primer（10 ?mol/l），pcr reverse primer（10 ?mol/l），dh20和cdna模板，迷你离心机混匀。两步法pcr扩增程序：预变性95 ℃、31 s；95 ℃、5 s，64 ℃、40 s，50个循环。上述组份在冰上配置。
　　β-actin作为对照，荧光实时pcr反应结束后，由系统分析软件确定阈值，进而确定各反应样本的ct值，采用相对定量的2-△△ct法分析pcr结果，确定各样本之间基因的表达差异。
　　3 统计学方法
　　采用spss13.0统计软件进行分析。结果用—x±s表示，数据符合正态分布，采用方差分析。p<0.05表示差异有统计学意义。
　　4 结果
　　hk-2细胞经tgf-β110 ng/ml作用24 h后，促纤维化细胞因子ctgf、pai-1 mrna的表达显著增强，抗纤维化细胞因子mmp-9 mrna表达减弱，与空白对照组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。但与糖耐康药物血清共同作用后，ctgf、pai-1 mrna的表达受到抑制，mmp-9 mrna表达上调，特别是药物血清中浓度、高浓度作用更为显著，与单纯tgf-β1 10 ng/ml比较差异有统计学意义（p<0.05），说明糖耐康具有调控tgf-β1诱导hk-2细胞纤维化因子mrna表达的作用，并且表现出一定的量效关系，而空白血清无类似作用。结果见表3。
　　5 讨论
　　现代医学针对肾间质纤维化的防治措施主要有应用血管紧张素转化酶抑制剂（acei）、血管紧张素受体拮抗剂、tgf-β1中和抗体或天然拮抗剂、基因治疗等诸多方面。但其抗肾纤维化效果并不理想。近年来， 中医药从扶正固本、活血化瘀、清热利湿、化浊排毒等多个角度，由单味中药、中药有效成分及中药复方制剂多方面进行抗纤维化的实验及临床研究，取得了一定的效果[3-4]。
　　目前研究发现，ctgf作为tgf-β的下游因子，是tgf-β活性的重要调节者，它与其受体结合诱导成纤维细胞增生、基质蛋白质合成及整合素的表达。在人活检标本组织损伤严重区域ctgf表达增加。研究发现，ctgf抗体或反义寡核苷酸可减少tgf-β刺激成纤维细胞和肾小球系膜细胞产生细胞外基质[5]。pai-1是血液中纤溶酶原激活剂最有效的生理性抑制剂，可由肾小管上皮细胞和肌成纤维细胞产生，tgf-β可促进它的表达，增加pai-1的量可以明显减少纤溶酶的产生，而纤溶酶可以降解多种基质蛋白——ⅳ型胶原、纤维结合素、层黏素、蛋白多糖以及纤

维蛋白；它可以激活mmps及胶原蛋白降解酶[6]。因此，pai-1可以调节肾小球膜内基质的量，在促肾间质纤维化过程中发挥重要作用[7]。mmps是一族锌、钙依赖肽链内切酶。mmps以酶原形式分泌，体内被激活的机制不清楚，体外可被纤溶酶原、激肽释放酶、组织蛋白酶g及尿激酶激活。mmps具有降解基质蛋白沉积的作用[8-9]。
　　糖耐康是治疗糖尿病的临床经验方。既往的研究表明，糖耐康具有调节糖尿病小鼠糖代谢、提高胰岛素敏感指数、减轻胰岛素抵抗、促进胰岛β细胞的修复和再生、调节脂代谢异常等作用[10]。我们以往的研究发现，糖耐康能够抑制高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的增殖，并能降低糖尿病gk大鼠尿蛋白量[11-12]，表明糖耐康对dn的发生和发展具有一定的治疗作用。
　　本实验主要探讨了糖耐康对tgf-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化过程中促纤维化细胞因子ctgf、pai-1和抗纤维化细胞因子mmp-9的作用。结果显示，人肾小管上皮细胞hk-2经tgf-β1诱导后，其纤维化促进因子ctgf、pai-1 mrna的表达显著上升，而纤维化抑制因子mmp-9 mrna的表达逐步减弱，再次证实了tgf-β1与肾间质纤维化发生的相关性。经糖耐康药物血清干预后，ctgf、pai-1 mrna的表达逐步下降，而mmp-9 mrna的表达逐步上升，说明糖耐康在肾间质纤维化过程中具有调控纤维化细胞因子网络的作用，在一定程度上可以抑制纤维化的发展。
　　参考文献：
　　[1] 李能娟，李红.肾小管上皮细胞表型转化与糖尿病肾病[j].国际内分泌代谢杂志，2006，26（4）：277-279.