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苗药金乌健骨方对CIA大鼠血清IL—1、IL—33的影响
【摘 要】目的:探讨金乌健骨方对胶原诱导性关节炎模型大鼠白细胞介素-1、白细胞介素-33的影响。方法:将40只wistar大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、金乌健骨方治疗组及雷公藤多苷对照组,每组10只,建立胶原诱导性关节炎模型大鼠,观察金乌健骨方及雷公藤多苷治疗4周后,胶原诱导性关节炎大鼠血清白细胞介素-1、白细胞介素-33含量变化。结果:模型组大鼠白细胞介素-1、白细胞介素-33的活性高于空白对照组(p < 0.05),与模型组比较,金乌健骨方组与雷公藤多苷组白细胞介素-1、白细胞介素-33的活性明显下降,差异有统计学意义(p < 0.05)。结论:金乌健骨方可抑制胶原诱导性关节炎大鼠白细胞介素-1、白细胞介素-33的活性。
  【关键词】 关节炎,胶原诱导性;白细胞介素-1;白细胞介素-33;金乌健骨方;大鼠
  类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是以众多细胞因子参与的侵蚀性滑膜炎为特点的自身免疫性疾病,以对称性多关节、小关节疼痛肿胀为主要表现,后期导致关节畸形及功能活动受限。其确切病因尚未明确,大多数学者认为与感染、遗传、免疫等因素有关。其发病机制复杂,目前研究主要集中在参与疾病的免疫细胞及炎症反应过程。课题组在前期临床观察[1-2]及实验研究中发现[3],金乌健骨方能控制患者的病情,提高临床疗效,改善生活质量,抑制大鼠多种炎症因子的表达。本实验通过苗药金乌健骨方对ra模型大鼠血清白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-33(il-33)的影响,探讨金乌健骨方对ra炎症介质的干预作用。www.11665.coM
  1 实验材料
  1.1 实验动物 清洁级雌性wistar大鼠[由重庆滕鑫生物技术有限公司提供,合格证号:scxk(渝)20070006]40只,6周龄,体质量(150±20)g。所有大鼠在相同条件下喂养,自由饮食、饮水,温度控制在18~22 ℃。
  1.2 主要试剂 牛ii型胶原,购于美国sigma公司;弗氏完全佐剂,购于美国sigma公司;醋酸,购于上海国药,商品编号:10000218;大鼠il-1 elisa试剂盒(m3300)、大鼠il-33 elisa试剂盒(rra00),购于美国r&d公司。
  1.3 主要仪器 电子天平:型号awh(sa)-1.5kg。台式冷冻离心机:德国sigma,货号a1330005。bio-tek 宝特 elx800酶标仪;大鼠足趾容积测量仪:上海软隆科技发展有限公司,规格:yls-7b。均由本院实验室提供。
  2 方 法
  2.1 试剂配制 用无菌蒸馏水配制为0.1 mol·l-1的醋酸溶液,将牛ii型胶原溶于0.1 mol·l-1醋酸溶液中,使浓度为2 mg·ml-1,放置于4 ℃冰箱过夜备用,次日与等体积弗氏完全佐剂在冰浴中充分乳化,配制成胶原乳剂浓度为1 mg·ml-1,于4 ℃冰箱保存备用。
  2.2 造模与分组 随机选取10只wistar大鼠作为空白对照组,其余各组大鼠参照文献[4]建立胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,cia)模型。于大鼠脊背部、尾根部皮下多点注射胶原乳剂0.4 ml,第14 天再予0.4 ml胶原乳剂加强免疫1次。将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、金乌健骨汤组和雷公藤对照组,每组10只。
  2.3 给 药 造模第21 天后,各组灌胃给药。金乌健骨方由金毛狗脊15 g、乌梢蛇10 g、千年健15 g、黑骨藤10 g、青风藤20 g、姜黄20 g、白芍15 g、三七粉3 g等8味中药组成(生药购自贵阳中医学院第二附属医院)。将金乌健骨方汤液浓缩至0.72 g·ml-1,
  每只大鼠给予金乌健骨方浓缩液3 ml;雷公藤多苷(湖南协力药业有限公司生产,国药准字z43020138)给药剂量为6 mg·kg-1·d-1。空白对照组与模型对照组分别予等体积的生理盐水灌胃,总疗程为4周(有少许大鼠于致炎后出现相互残杀及不明原因死亡,未做具体死亡原因分析)。
  2.4 观测指标
  2.4.1 关节肿胀率 观察大鼠在整个实验过程中活动、毛色、饮食变化情况及四肢关节局部病变情况。于灌胃前及灌胃后1,2,3,4周用大鼠足趾容积测量仪测大鼠右侧关节的容积,计算其关节肿胀率,以第1天测值为基值,以后每测得的值与之相比所得比值为关节肿胀率。
  2.4.2 il-1、il-33的测定 予乌拉坦腹腔麻醉后行股动脉取血于15 ml离心管中,静置20 min后,在4 ℃下2000 r·min-1离心15 min,取上清液分装于-20 ℃保存,用于elisa法检测。具体按试剂盒内说明书操作,用酶标仪(450 nm)读取od值,建立标准曲线,根据标准曲线分别计算各样本的il-1、il-33浓度。

 2.4.3 关节病理 处死大鼠,取右侧踝关节组织,制作病理切片,用he染色,光镜观察关节滑膜及周围组织的病理变化。
  2.5 统计学方法 采用spss 16.0软件进行统计分析,计量资料以表示,符合正态分布用方差分析,不符合正态分布采用非参数检验。
  3 结 果
  3.1 一般状态 空白对照组大鼠精神活动正常,反应灵敏,能正常活动、摄食、饮水,体重增加。造模组大鼠自造模后第15天出现少动、喜卧、舔足等表现。双后肢由跖趾关节至踝关节出现不同程度的肿胀,第21天达高峰,关节红肿逐渐加重,甚至出现膝关节、双前肢关节红肿,爬行困难,精神萎靡,毛色泛黄无光泽,摄食及饮水较空白对照组减少,体重无增加或减低。金乌健骨汤组及雷公藤对照组自灌胃治疗后,上述表现逐渐改善,见图1。
  3.2 关节肿胀率变化 自造模始第15天大鼠关节出现肿胀,21 d达高峰,差异均有统计学意义 (p < 0.05或p < 0.01)。经金乌健骨方与雷公藤多苷灌胃治疗28 d后,关节肿胀率与模型对照组比较,差异有统计学意义(p < 0.05)。见表1。
  3.3 各组大鼠右侧踝关节病理光镜切片观察 空白对照组关节软骨面光滑,滑膜细胞排列规则;模型对照组滑膜组织增生,细胞排列紊乱,骨质破坏;金乌健骨汤组及雷公藤对照组滑膜组织细胞纤维化,炎性细胞浸润减少。见图2。
  (1)空白对照组 (2)模型对照组
  (3)金乌健骨汤组 (4)雷公藤对照组
  图2 各组大鼠右侧踝关节病理光镜切片 (he染色×20)
  3.4 大鼠血清il-1、il-33检测结果 模型对照组较空白对照组大鼠血清il-1、il-33明显升高,金乌健骨汤组、雷公藤对照组、模型对照组减低,差异有统计学意义(p < 0.05),见表2。
  表2 各组大鼠血清il-1、il-33的比较 组别 动物数
  (只) il-1
  (ng·l-1) il-33
  (pg·ml-1)
  空白对照组 10 17.89± 9.23 238.85±16.72
  模型对照组 8 138.87± 9.131) 271.96±25.451)
  金乌健骨汤组 8 121.22± 9.202) 242.57±20.152)
  雷公藤对照组 9 117.75±10.892) 246.80±16.432)
  注 1)与空白对照组比较,p < 0.05;2)与模型对照组比较, p < 0.05
  4 讨 论
  ra是发病率高、致残率高的慢性炎症性关节病,其病理特点为关节滑膜炎、滑膜细胞增生、血管翳形成、软骨及骨质破坏,最终导致关节强直及功能丧失。但ra的发病机制至今尚未完全阐明,大多数研究表明,免疫细胞的激活和炎症因子的介导起着至关重要的作用。il-1在ra患者的外周血及关节液中呈高浓度表达已得到公认,且有研究表明,il-1受体拮抗剂在ra的治疗中取得了一定的进展[5-6] 。il-1可诱导多种炎症基因的表达,增强炎症反应的过程,而局部的免疫复合物及炎症反应产物可刺激il-1的合成,从而形成恶性循环。这一过程均可促进软骨与骨质的破坏,抑制新骨的形成。il-1家族成员具有强大的促炎作用,il-33是新发现的il-1家族的细胞因子[7]。近来研究发现,il-33通过刺激肥大细胞分泌细胞因子il-1、白细胞介素-6(il-6)等,促进骨关节的破坏及进展,可以促进ra的发病,加重cia小鼠关节滑膜炎[8]。il-33在ra患者血清及关节滑液中均有表达,且活动期水平高于缓解期,与rf、抗ccp抗体呈正相关,但与疾病的活动无明显相关性[9]。
  ra属中医学“痹病”范畴,又有称“历节病”“鹤膝风”“骨痹”等。《内经》最早提出了风寒湿邪与机体“内外相合”致痹的观点,认为“风寒湿三气杂至,合而为痹也”。金乌健骨方是贵州苗族同胞长期用于治疗痹证的有效经验方,由金毛狗脊、乌梢蛇、千年健、黑骨藤、三七粉、青风藤、白芍、姜黄等药组成,全方具有温肾助阳、散寒通络、活血止痛之功效,使筋骨健、经络通、寒凝散、瘀血化,邪退而正不伤。
  炎症因子的刺激及免疫反应在ra病程的发生发展过程中起主要作用。本研究结果显示,il-1及il-33可能在某种程度上参与了ra的发病过程,且这一结果符合国内报道。金乌健骨方能改善大鼠关节的肿胀程度,在一定程度上降低cia大鼠的il-1、il-33表达水平,能为金乌健骨方在临床中提供实验依据。但因该方为中药复方,其成分复杂,对胶原诱导性关节炎实验研究和ra患者的临床观察的有效性机制还有待于进一步研究。
  5 参考文献
  [1]

黄华,曹跃鹏,姚血明,等.金乌健骨汤配合改善病情抗风湿药治疗类风湿关节炎疗效观察[j].风湿病与关节炎,2012,1(1):31-33.
  [2] 马武开,钟琴,姚血明,等.苗药金乌健骨汤对寒湿阻络型类风湿关节炎患者生存质量的影响[j].风湿病与关节炎,2013,2(7):8-11.
  [3] 马武开,姚血明,黄颖,等.金乌健骨方对关节炎模型大鼠的抗炎作用研究[j].医药导报,2013,32(5):569-572.
  [4] larson p, kleinau s,holmdahl r.homologous type ii collagen-induced arthritis in rats[j].arthritis rheum,1990,33(5):693-701.
  [5] 黄火高,韩星海,赵东宝.白细胞介素-1受体拮抗剂治疗类风湿关节炎[j].中华风湿病学杂志,2003,7(10):617-620.
  [6] 杨高云,狄春辉,蒋明,等.白介素i受体拮抗剂基因治疗小鼠2型胶原关节炎的疗效观察[j].中华医学杂志,2002,82(14):990-994.
  [7] schmitz j,owyang a,oldham e,et al.il-33,an interleukin-1-like cytokine that signals via the il-1 receptor-related protein st2 and induces t helper type 2-associated cytokines [j].immunity,2005,23(5):479-490.
  [8] xu d,jiang hr,kewin p,et al.il-33 exacerbates antigen-induced arthritis by activating mast cells[j].proceeding of the nattional academy of sciences of the united states of america,2008,105(31):10913-10918.
  [9] 李芳芳,朱芸,李彬.il-33在类风湿关节炎中的作用研究[j].心理医生,2011,10:1451-1453.
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  •  作者:佚名 [标签: 大鼠 血清 影响 ]
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