摘要：以甘农4号紫花苜蓿下胚轴诱导所得愈伤组织为材料，研究酶液组合，渗透压调节物甘露醇浓度，酶解时间，愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响。结果表明：当酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶，渗透压为0.6 mol/l甘露醇，愈伤组织继代培养时间为12 d，预处理措施为在cpw11溶液中预质壁分离1 h，酶解时间10～12 h时，游离出的原生质体产量最高，可达3.34×106 个/g，原生质体活力高达82.8%。
关键词：甘农4号紫花苜蓿；愈伤组织；原生质体；酶解条件
甘农4号紫花苜蓿（medicago sativa cv.gannong no.4）是从6个欧洲苜蓿品种中选择多个优良单株，经母系选择法选育而成。该品种株型紧凑直立，茎枝多，节间长，草层整齐，在初期生长快，可提高建植第1年的草产量，生态适应性广泛，适宜在西部大部分地区栽培。但该品种也存在抗逆性差，病虫害严重，木质素含量高等缺点[1]。
植物原生质体可以由植物原生质体通过酶解大量获得，且具有全能性，可融合性，可转化性，所以是进行作物改良的有效途径之一[2]。在苜蓿中已有许多关于原生质体培养获得再生植株[3-6]、原生质体融合[7，8]以及转基因技术应用[9，10]等方面的报道。但是对甘农4号紫花苜蓿的报道仅限于愈伤组织培养再生植株的报道[11，12]。因此，以甘农4号紫花苜蓿愈伤组织为实验对象，研究酶解因素对其原生质体分离效果的影响，优化酶解条件，为甘农4号紫花苜蓿品种改良奠定基础。wwW.11665.cOM
1 材料和方法
1.1 试验材料
甘农4号紫花苜蓿种子由甘肃农业大学草业学院提供。
将成熟饱满的种子先在蒸馏水中浸泡30 min，再用0.1%升汞溶液浸泡10 min，然后，用酒精溶液浸泡1 min，最后在无菌水中洗涤3～5次后接种在1/2ms培养基上，培养条件为25 ℃，2 500 lx，16 h光周期[13，14]。待子叶完全展开而真叶尚未长出时，将下胚轴剪切为3～5 mm节段，于ms+2.0 mg/l 2，4d +1.5 mg/l 6ba+1.5 mg/l naa培养基中诱导愈伤组织[10，15]，待形成稳定的细胞培养系后，挑选色泽鲜艳，组织结构明显的愈伤组织（图1），用于原生质体游离实验。
1.2 原生质体的分离与纯化
酶解液由不同浓度的纤维素酶，果胶酶，离析酶，崩溃酶及半纤维素酶组成（表1），并溶于cpw11溶液中（配方为27.2 mg/l kh2po4，101.0 mg/l kno3，1 480.0 mg/l cacl2·2h2o，246.0 mg/l mgso4·7h2o，0.16 mg/l ki，0.025 mg/l cuso4·5h2o，5.0 mmol/l mes，甘露醇浓度为11%），ph调至5.8～5.9，用0.22 μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。
称取1 g愈伤组织置于盛有10 ml酶液的三角瓶，在25 ℃，50 r/min的摇床黑暗培养。酶解结束后将三角瓶内的液体依次经100目、400目尼龙网筛过滤，滤液收集在15 ml离心管内，800 r/min离心7 min，收集底部沉淀的原生质体，再依次用cpw11溶液和km8p溶液洗涤2～3次，得到纯化的原生质体[12，16-18]。
1.3 酶解条件的筛选
分别对酶液渗透压、酶解时间、愈伤组织继代时间和预处理措施4个影响原生质体分离的主要酶解条件进行实验。以甘露醇为酶液渗透压的调节物，设0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70 mol/l共6个浓度进行实验；再对酶解持续的时间设6、8、10、12、14、16 h共6个处理进行筛选；之后以继代培养至6、8、10、12、14、16 d的愈伤组织作为酶解材料；设置暗培养（0 lx、24 h），低温培养（4 ℃、24 h）、质壁分离（cpw11溶液中浸泡1 h）及对照（25 ℃、光周期16 h）4个预处理措施进行筛选[12，19-21]。筛选时以不同处理中原生质体产量及活力为衡量依据，得出最佳酶解条件。
1.4 原生质体产量及活力的测定
用血球计数器测定原生质体产量。吸取少量纯化后的原生质体悬浮于血球计数板上，于显微镜下观察统计原生质体个数（中央大方格内25个中方格里的细胞数）。原生质体活力的测定采用荧光染料荧光素双醋酸盐（fda）活体染色法。fda用丙酮配制5 mg/ml溶液，吸取25 μl/ml与原生质体悬浮液混合均匀。取1滴染色后的原生质体悬浮液滴在载玻片上，静置5 min后于荧光显微镜下观察其活力[22]。观察时随机选取视野，统计视野中发绿色或黄绿色荧光的细胞数。
1 ml悬浮液中原生质体个数= 1个方格悬浮液（0.1 mm3，即0.1 μl）中的细胞数×10×1000
原生质体产量（个/g）=原生质体
度（个/ml）×原生质体悬浮液的总体积（ml）/材料总质量（g）
原生质体活力=（有活力的原生质体个数/原生质体总数）×100%
2 结果与分析
2.1 酶液组合对原生质体分离的影响
以不同浓度的纤维素酶，果胶酶，离析酶，崩溃酶和半纤维素酶组合成5种酶液，酶解时均挑选新鲜培养基上的愈伤组织并保持其他酶解条件一致，在此条件下比较5种酶液组合对原生质体分离效果的影响。结果表明（图2），ⅰ是酶成分最单一的酶液组合，原生质体产量和活力最低，为1.41×106 个/g和53.7%，其余酶组合均是在ⅰ基础上添加其他水解酶组成，效果均优于ⅰ。其中，ⅳ的原生质体产量和活力最高，为2.75×106 个/g和71.6%；ⅱ、ⅲ、ⅴ相比，ⅴ的酶种类丰富，游离出的原生质体产量和活力（2.35×106 个/g，65.4%）相对较高，而ⅱ、ⅲ游离出的原生质体产量和活力相对较低，分别为1.95×106 个/g、1.57×106 个/g和64.7%、54.7%。综上可说明ⅳ中所含的0.3%半纤维素酶有利于甘农4号紫花苜蓿愈伤组织游离原生质体，显著提高了原生质体产量和活力，而0.3%离析酶和0.3%崩溃酶对甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离的效果较差。因此，2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶是最适宜甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离的酶液配比。 2.2 甘露醇浓度对原生质体分离的影响
酶液中甘露醇浓度不同，使浸泡悬浮在其中的植物细胞渗透压不同，从而影响原生质体分离效果。结果表明（图3），在不同浓度处理中，随着甘露醇浓度的增加，原生质体产量逐渐增加，原生质体活力也缓慢提高，当甘露醇浓度为0.6 mol/l时，原生质体产量和活力达到最大值，分别为2.77×106 个/g和71.8%，此时的原生质体产量和活力显著高于其他浓度水平，且游离出的原生质体边缘清晰，碎片少，细胞完整度高。之后原生质体产量和活力随甘露醇浓度的增加而显著降低，并伴随产生大量细胞碎片。由此说明浓度为0.6 mol/l的甘露醇为最佳酶液渗透压调节浓度。
2.3 酶解时间对原生质体分离的影响
酶解时间的不同对原生质体产量、活力和细胞完整性产生显著影响。在最佳酶组合和甘露醇浓度基础上设6个不同酶解时间，结果表明（图4），当酶解时间延长时，原生质体的产量和活力均先逐渐增加，后缓慢降低。酶解时间小于8 h时，游离出的原生质体产量和活力较低，分别为1.96×106 个/g和55.4%，均不能有效游离出大量原生质体，说明酶解时间不够充分。当酶解延长至10 h时，原生质体产量和活力达到最高，为2.98×106 个/g和75.2%，其中，原生质体产量仅与酶解12 h的产量（2.85×106个/g）相似且显著高于其他酶解时间，而活力显著高于酶解12 h（71.9%）及其他酶解时间。说明酶解10～12 h愈伤组织与酶解液反应充分，能解离出大量有活力的原生质体，因此，甘农4号紫花苜蓿愈伤组织的最佳酶解时间为10～12 h。
2.4 愈伤组织继代培养时间对原生质体分离的影响
以2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶+0.6 mol/l甘露醇，酶解10～12 h为基础，设6个愈伤组织继代时间梯度，研究不同继代时间对愈伤组织原生质体分离的影响。结果表明（图5），愈伤组织继代8～12 d原生质体产量和活力的增加趋势显著，而继代14～18 d虽然愈伤组织的体积增大细胞数量增多，但原生质体的产量和活力逐渐降低，说明细胞逐渐趋于衰老死亡。继代至12 d时原生质体产量和活力达到最大值，为3.17×106 个/g和78.4%，显著高于其他继代梯度，且获得的原生质体饱满完整，因此认为继代至12 d的甘农4号紫花苜蓿愈伤组织最适宜进行酶解。
2.5 预处理措施对原生质体分离的影响
2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶+0.6 mol/l甘露醇酶解10～12 h，愈伤组织继代12 d的基础上对预处理条件进行实验，结果表明（表2），愈伤组织在cpw11溶液中经过1 h的质壁分离处理对原生质体的游离有明显促进作用，其原生质体产量和活力（3.34×106个/g，82.8%）显著高于对照处理（3.18×106个/g，78.5%）；而暗处理和低温处理的原生质体产量和活力分别为2.64×106个/g，2.90×106个/g和72.3%，73.3%，均低于对照，说明暗处理和低温处理对原生质体的游离并未产生促进作用。因此cpw-11溶液中预质壁分离1 h是甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体分离最佳的预处理措施。
3 讨论
3.1 酶液组合成分，渗透压及酶解时间
对原生质体分离的影响
植物原生质体是指脱去了植物细胞特有的细胞壁，仅仅由质膜包裹着的裸露细胞[2，9]，因此，原生质体分离的关键是酶解去除细胞壁，而获得完整的细胞。其中，影响细胞壁酶解的主要因素是酶液种类、浓度和酶解时间，由于供试材料的种类差异，适宜的酶种类及浓度、酶解时间各不相同[12，17-21]。
采用纤维素酶、果胶酶、离析酶、崩溃酶、半纤维素酶进行酶液组合实验，发现2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶为最佳酶液配比，所获得的原生质体产量多活力强，这与王娟等[19]以阿尔冈金苜蓿愈伤组织为材料酶解原生质体所用的最佳酶液配比有所不同，这一结果说明虽然实验材料均为苜蓿，但适宜不同的苜蓿品种的酶液组合不同。甘农4号紫花苜蓿愈伤组织在上述酶液组合中酶解10～12 h获得的原生质体产量和活力为最高值，若酶解过短则不能充分释放原生质体，而酶解时间过长原生质体长时间浸泡在酶解液中，从而导致质膜破裂，降低原生质体产量和活力，这与陶茸等[20]在研究扁蓿豆原生质体酶解条件的结果相似。
以适当浓度的甘露醇作为渗透压调节物，能有效控制脱壁后的细胞保持完整性，防止原生组织发生破裂，从而提高原生质体活力。目前，建立的各种植物原生质体分离体系中，以0.35～0.80 mmol/l[22]的渗透压浓度为适，其中，草地早熟禾要求0.4 mol/l甘露醇[23]，百脉根里奥愈伤组织适宜浓度为0.55 mol/l[12]。不同苜蓿品种对渗透压的要求也不同，南方紫花苜蓿子叶及子叶愈伤组织要求甘露醇浓度为0.4 mol/l[5]，舒文华等[6]利用苜蓿叶片游离原生质体适宜的甘露醇浓度为0.6 mol/l，这一结果与此次实验的结果一致。
3.2 愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体分离的影响
愈伤组织的继代培养是将生长至一定时间、状态良好的愈伤组织转移到新鲜的培养基中继续增殖生长，以保持其鲜活的状态，而在增殖过程中愈伤组织的生理状态随时间延长而发生变化，因此，对原生质体的游离效果产生一定影响。植物种类或品种不同，愈伤组织的生长速度和继代时间不同，在张改娜[7]对3种豆科牧草原生质体分离培养的研究中发现，骆驼刺发根农杆菌a4转化系愈伤组织的最佳继代时间为8 d，而甲硫氨酸抗性系鹰嘴紫云英愈伤组织继代时间却以12 d为宜，此次实验所得的结果表明，甘农4号紫花苜蓿愈伤组织继代最佳时间为12 d。
适当的预处理措施可以有效的改善细胞生理状态或减轻细胞膜在酶解时的损伤，从而提高原生质体产量、活力和完整性。实验在酶解前将材料于cpw11溶液中浸泡1 h，使细胞壁内的原生质体部分收缩，改变细胞膜结构，减小酶解时细胞壁破损面积，从而有效提高了原生质体产量和活力。这一结果与陶茸等[21]对陇东野生紫花苜蓿原生质体分离预处理结果相似。 4 结论
对甘农4号紫花苜蓿愈伤组织进行原生质体分离，筛选了适宜的酶解条件。即最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶，渗透压调节剂为0.6 mol/l甘露醇，酶解时间为10～12 h，愈伤组织继代时间为12 d，最佳预处理措施为酶解前将酶解材料在cpw11溶液中预质壁分离1 h，此时原生质体产量和活力分别高达3.34×106 个/g，82.8%。
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